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Odontologia Clínico-Científica (Online)

versão On-line ISSN 1677-3888

Odontol. Clín.-Cient. (Online) vol.10 no.3 Recife Jul./Set. 2011

 

ARTIGO ORIGINAL / REVIEW ARTICLE

 

Screening da atividade antifúngica de óleos essenciais sobre cepas de candida

 

Screening of essential oils' antifungal activity on candida strains

 

 

Yuri Wanderley CavalcantiI; Leopoldina de Fátima Dantas de AlmeidaII; Wílton Wilney Nascimento PadilhaIII

I Aluno de Graduação do Curso de Odontologia Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa - PB/Brasil
II Aluna do Programa de Pós-Graduação em Odontologia (Odontologia Preventiva Infantil) da Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa – PB/Brasil
III Professor Doutor Titular de Clínica Integrada – Departamento de Clínica e Odontologia Social da Universidade Federal da Paraíba, DCOS-UFPB

Endereço para correspondência

 

 


RESUMO

Realizar screening da atividade antifúngica in vitro dos óleos essenciais de Melaleuca alternifolia (melaleuca), Cymbopogon winterianus (citronela) e Rosmarinus officinalis (alecrim) sobre cepas de Candida albicans (ATCC289065) – M1, C. krusei (ATCC40147) - M2 e C. tropicalis (ATCC13803) – M3. Material e Método: A atividade antifúngica dos óleos essenciais foi verificada pela técnica de difusão em agar. Suspensões fúngicas (1,5x106 microrganismos/mL) foram semeadas em placas de agar Sabouraud-Dextrose sobre as quais foram distribuídos quatro discos de papel estéreis. Os espécimes foram inundados com 50μL das soluções testadas e do controle, em formulação pura. Os testes foram realizados em triplicata, e a Nistatina (suspensão comercial - 100.000UI/mL) serviu de controle. Os halos de inibição do crescimento fúngico, em milímetros, foram mensurados e analisados descritivamente pela obtenção de médias e desvio-padrão. Resultado: Para M. alternifolia, C. winterianus, R. officinalis e Nistatina, a média dos halos de inibição do crescimento foi respectivamente: 12,0(+2,64); 28,3(+9,60); 9,6(+2,08) e 11,6(+0,58) para M1; 10,0(+0,0); 13,3(+0,58); 9,3(+0,58) e 9,6(+0,58) para M2; e 10,3(+0,58); 26,3(+6,35); 8,6(+0,58) 3 10,6(+0,58) para M3. Conclusão: Nas condições deste estudo, concluiu-se que os óleos essenciais de C. winterianus, M. alternifolia e R. officinalis apresentaram atividade antimicrobiana sobre as cepas testadas.

Descritores: Óleos voláteis; Produtos biológicos; Candidíase bucal; Produtos com ação antimicrobiana.


ABSTRACT

To conduct the screening of in vitro essential oils' antifungal activity from Melaleuca alternifolia (tea tree), Cymbopogon winterianus (citronella) and Rosmarinus officinalis (rosemary) on strains of Candida albicans (ATCC289065) - M1, Candida krusei (ATCC40147) - M2 and Candida tropicalis (ATCC13803) - M3. Material and Method: The antifungal activity of essential oils was determined by agar diffusion technique. Fungal suspension (1.5 x 106 organisms/ml) were sowed in Sabouraud Dextrose agar, which were distributed on four discs of sterile paper. The specimens were inundated with 50μl of tested solutions and control in pure formulation. The tests were performed in triplicate and nystatin (commercial suspension - 100,000 IU/ml) served as control. The inhibition areas of fungal growth in millimeters were measured and analyzed descriptively by obtaining means and standard deviation. Result: For M. alternifolia, C. winterianus, R. officinalis and Nystatin, the average of the inhibition growth zones were, respectively: 12.0(+2,64), 28.3(+9,60), 9.6(+2,08) and 11.6(+0,58) to M1; 10.0(+0,0), 13.3(+0,58), 9.3(+0,58) and 9.6(+0,58) to M2; and 10.3(+0,58), 26.3(+6,35), 8.6(+0,58) and 10.6(+0,58) to M3. Conclusion: In this study conditions, was concluded that the essential oils from C. winterianus, M. alternifolia and R. officinalis showed antifungal activity against the tested strains.

Keywords: Oils; Volatile; Biological products; Products with antimicrobial action; Drug evaluation; preclinical Condicliasis; Oral.


 

 

INTRODUÇÃO

Dentre as infecções humanas de natureza fúngica, a candidíase bucal é a mais comum, sendo descrita como uma infecção oportunista, frequentemente envolvida com a alteração da microbiota bucal, doenças sistêmicas e redução da imunidade do hospedeiro1,2.

Entre as espécies envolvidas com o desenvolvimento da candidose oral, a Candida albicans é a mais prevalente e de maior patogenicidade1-3. C. tropicalis, C. krusei, C. parapsilosis e C. guilliermondii também fazem parte do curso da doença e, junto a C. albicans, chegam a representar mais de 80% dos isolados clínicos1-3,4.

Diante da utilização de alguns medicamentos antifúngicos sintéticos, as espécies de Candida têm se mostrado resistentes5,6. Com o objetivo de identificar substâncias alternativas ao uso de medicamentos tradicionais, foram desenvolvidos estudos sobre a atividade antimicrobiana de óleos essenciais7-11. Dessa forma, a busca de produtos naturais que apresentem uma ação antifúngica eficiente frente a microrganismos resistentes se mostra uma alternativa necessária ao controle da candidose oral6-13.

A triagem (screening) da atividade antimicrobiana de produtos naturais tem como objetivo investigar, em parte, a validade do conhecimento popular sobre o uso dessas substâncias nos cuidados em saúde14. Investigações etnobotânicas identificaram o uso popular de C. winterianus, M. alternifolia e R. officinalis15,16, o que justifica a realização do presente estudo.

A atividade antimicrobiana do óleo essencial de Rosmarinus officinalis (alecrim) sobre espécies de Candida foi descrita por Lima et al.7 (2006), Fontenelle et al.9 (2007) e Packer e Luz17 (2007). Para o óleo essencial de Cymbopogon winterianus (citronela), foi verificada atividade antifúngica sobre espécies de Aspergillus, Rhizopus, Penicillium e Fusarium18. O óleo essencial de Melaleuca alternifolia (melaleuca) teve atividade antifúngica relatada por vários estudos17-23. Porém, segundo Carson et al.23 (2006), ainda há poucas evidências clínicas sobre a eficácia de óleos essenciais contra infecções bacterianas, fúngicas e virais.

Dessa forma, o objetivo deste estudo foi o de realizar screening da atividade antifúngica in vitro dos óleos essenciais de Melaleuca alternifolia (melaleuca), Cymbopogon winterianus (citronela), e Rosmarinus officinalis (alecrim) sobre cepas de Candida albicans (ATCC 289065), C. krusei (ATCC 40147) e C. tropicalis (ATCC 13803).

 

MATERIAL E MÉTODO

Realizou-se um estudo de abordagem indutiva, com procedimento comparativo estatístico e técnica de documentação direta em laboratório24.

Para avaliação antifúngica in vitro, foram utilizados óleos essenciais de Melaleuca alternifolia (melaleuca), Cymbopogon winterianus (citronela) e Rosmarinus officinalis (alecrim). Esses produtos foram obtidos da empresa Ferquima® (Ind. e Com. Ltda), a qual cedeu Laudo Técnico com especificações, conforme apresentado no Quadro 1.

 

 

 

As cepas de referência utilizadas no estudo foram Candida albicans (ATCC 289065), C. krusei (ATCC 40147) e C. tropicalis (ATCC 13803). Os microrganismos foram obtidos do Laboratório de Materiais de Referência do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (Fundação Oswaldo Cruz – FIOCRUZ, Rio de Janeiro - RJ, Brasil). As cepas foram reativadas em Caldo Sabouraud-Dextrose, a 37ºC e estocadas em agar Sabouraud-Dextrose 4%, no Laboratório de Microbiologia Oral – Núcleo de Medicina Tropical do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Paraíba. Para condução do estudo, suspensões fúngicas dos microrganismos foram preparadas em solução salina, sob a concentração 1,5x106 microrganismos/ mL, comparável ao tubo 106 da Escala de MacFarland.

A atividade antifúngica dos óleos essenciais foi verificada pela técnica de difusão em agar (disco-difusão). Discos de papel estéreis (diâmetro de 6mm) foram embebidos previamente com 50μL das soluções testadas e do controle, em formulação pura. Realizou-se a semeadura das suspensões fúngicas (1,5x106 microrganismos/mL) em placas de agar Sabouraud-Dextrose, sobre as quais foram distribuídos quatro discos, cada um deles embebido com uma solução testada diferente. As placas foram incubadas em estufa bacteriológica, a 37ºC, por 48h. Os testes foram realizados em triplicata e comparados ao controle positivo (Nistatina, suspensão comercial - 100.000UI/mL).

Os halos de inibição do crescimento fúngico foram mensurados em milímetros, com o auxílio de um paquímetro. Os dados foram tabulados no programa GraphPad Prism 5.0 (Programa PraphPad for Windows, San Diego, CA - USA), sendo obtidas suas médias e seus desvios-padrão.

 

RESULTADOS

As médias e os desvios-padrão dos halos de inibição do crescimento provocado pelos produtos testados sobre as cepas de Candida são visualizados na Tabela 1.

 

 

 

DISCUSSÃO

A técnica de disco-difusão em agar é uma das estratégias utilizadas como triagem da atividade antimicrobiana in vitro de óleos essenciais5-14-25,26. Destaca-se, também, a necessidade de padronização das técnicas empregadas, de modo a viabilizar a sua reprodutibilidade e a comparação com outros estudos8-17. Dessa forma, baseando-se na metodologia descrita e na comparação com o controle positivo, os resultados deste estudo são válidos e podem ser comparados a outros relatos da literatura.

Segundo estudo etnobotânico desenvolvido por Silva et al.16 (2009), a C. winterianus é utilizada popularmente como repelente para mosquitos. Entre os produtos avaliados, o óleo essencial de C. winterianus apresentou maior atividade antimicrobiana frente a cepas de Candida. No entanto, não foram identificados, na literatura, estudos sobre a atividade antifúngica desse produto sobre Candida spp.

A atividade antifúngica do óleo essencial de C. winterianus foi investigada por Souza et al.18 (2005), os quais avaliaram a efetividade desse produto sobre espécies de Aspergillus, Rhizopus, Penicillium e Fusarium. Prabuseenivasan, Jayakumar e Ignacimuthu25 (2006) avaliaram a atividade antimicrobiana de C. winterianus sobre bactérias Gram negativas e Gram positivas. Para ambos os estudos, o óleo essencial de C. winterianus apresentou atividade antimicrobiana adequada. Dessa forma, os resultados deste estudo corroboram os escassos relatos da literatura sobre a atividade antimicrobiana de C. winterianus.

Segundo especificações do fornecedor, o Citronelal e o Geraniol foram os principais constituintes químicos das amostras do óleo essencial de C. winterianus utilizadas neste estudo, o que é sustentado por Cassel e Vargas27 (2006) e Blank et al.28 (2007). Segundo os mesmos autores, esses componentes são responsáveis pelas atividades repelente e antimicrobiana do produto, o que justifica a ação antifúngica do óleo essencial de C. winterianus, verificada neste estudo.

A atividade antimicrobiana do óleo essencial de M. alternifolia sobre Candida spp corrobora os achados da literatura19-29. A atividade antifúngica do óleo essencial de M. alternifolia sobre espécies de Candida deve-se ao componente terpinen-4-ol, o que provavelmente justifica a atividade antifúngica identificada neste estudo19,21,23.

A Concentração Inibitória Mínima (CIM) e a Concentração Fungicida Mínima (CFM) do óleo essencial de M. alternifolia foram determinadas pelos estudos de Oliva et al.19 (2003), Mondello et al.22 (2003), Carson et al.23 (2006) e Hammer et al.29 (2002). Em todos esses estudos, a CIM do óleo essencial de M. alternifólia foi inferior a 1%, e a CFM, inferior a 8%. Assim, a atividade antifúngica desses produtos em baixas concentrações indica forte potencial antimicrobiano29.

Packer e Luz17 (2007), Fontenelle et al.9 (2007) e Lima et al.7 (2006) avaliaram a atividade antifúngica do óleo essencial de R. officinalis sobre Candida spp. Os principais constituintes químicos do óleo essencial de R. officinalis variaram entre os estudos, não sendo encontrada consonância entre os relatos e a composição das amostras utilizadas nessa investigação. Enquanto o 1,8 Cineol, o limoneno e o para-cimeno compuseram 47% do óleo essencial de R. officinalis, em outros estudos, o α-pineno30 e o timol9 representaram os principais constituintes.

A atividade biológica dos óleos essenciais tem-se mostrado dependente dos principais componentes químicos, como terpinenol, citronelal, cineol, limoneno e cimeno. Esses constituintes são responsáveis pelas propriedades antissépticas e antimicrobianas dos óleos essenciais e devem ter suas propriedades físico-químicas e biológicas estudadas18-21.

Fontenelle et al.9 (2007) e Lima et al.7 (2006) avaliaram a atividade antifúngica in vitro pela determinação da concentração inibitória mínima (CIM) do óleo essencial de R. officinalis sobre Candida spp. Apesar de não representar objeto de investigação deste estudo, a determinação da CIM em baixas concentrações (1250mg/mL9 e 8%7) indica adequada atividade antifúngica.

Quanto à ação antifúngica dos óleos essenciais de M. alternifolia e R. officinalis, Packer e Luz17 (2007) identificaram halos de inibição do crescimento superiores a 60mm para C. albicans. No estudo de Packer e Luz17 (2007), as amostras dos óleos essenciais, utilizadas para o teste de difusão em agar, foram associadas ao Tween 80, com o objetivo de reduzir a tensão superficial dos produtos (característica apolar) e permitir a melhor difusão em agar (característica polar). Assim, a diferença entre os resultados do presente estudo e as medidas de inibição do crescimento obtidas por Packer e Luz17 (2007) se justificam pela adição do Tween 80 aos óleos essenciais.

Para determinação da concentração inibitória mínima do óleo essencial de M. alternifolia, o estudo de Oliva et al.19 (2003) também realizou a associação dos óleos essenciais com Tween 80. Assim, diante da condução de ensaios para avaliação antimicrobiana de óleos essenciais, recomenda-se a utilização de agentes tenso-ativos (a exemplo do Tween 80), com o objetivo de permitir maior interação com substâncias polares in vitro.

A Nistatina (Suspensão Comercial - 100.000UI/mL) e os óleos essenciais de M. alternifolia e R. officinalis não apresentaram atividade antimicrobiana estatisticamente diferentes entre si. Dessa forma, além de corroborar os achados de Packer e Luz17 (2007), esses resultados sugerem comportamento semelhante ao medicamento de uso clínico.

Os produtos testados e o controle positivo apresentaram atividade antifúngica. Assim, verifica-se a necessidade de se aprofundarem as investigações sobre a atividade antifúngica desses produtos, com o objetivo de justificar e validar o uso clínico dos óleos essenciais. Sugere-se, portanto, novos ensaios para fundamentar o uso desses produtos naturais como agentes medicinais.

A metodologia empregada neste estudo demonstrou a existência de atividade antifúngica dos produtos testados, não sendo possível, nessa fase, comparar o desempenho dos óleos essenciais. Após a identificação da presença de atividade por meio de triagem, os estudos subsequentes devem considerar a avaliação da atividade antifúngica diante de cepas clínicas e outras linhagens padronizadas, empregando técnicas que considerem o isolamento de fitoconstituintes, a aderência celular, a formação de biofilme in vitro, a influência da saliva humana e a toxicologia desses produtos.

 

CONCLUSÕES

Nas condições deste estudo, concluiu-se que os óleos essenciais de C. winterianus, M. alternifolia e R. officinalis apresentaram atividade antimicrobiana sobre as cepas testadas.

 

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Endereço para correspondência:
Yuri Wanderley Cavalcanti
Av. Des. Hílton Souto Maior, 6701. Qd. 765, Lt. 117. Portal do Sol
João Pessoa – Paraíba/Brasil CEP: 58046-600
E-mail: yuri.wanderley@yahoo.com.br

 

Recebido para publicação: 01/03/11
Aceito para publicação: 07/04/11