Autores: Luana Lira Cadete
Orientador: Mario de Andrade Lira Junior

Universidade Federal Rural de Pernambuco, RUA DOM MANUEL DE MEDEIROS, S/N, DOIS IRMAOS, 52171-900, RECIFE-, (81) 3441- 4577, postmaster@nelore.npde.ufrpe.

A fixação biológica de nitrogênio por leguminosas é a principal fonte biológica de N na agricultura, e sob uma grande variedade de situações, a mais importante fonte deste nutriente, em particular no mundo tropical. Esta fixação é baseada na simbiose entre a leguminosa e bactérias tradicionalmente conhecidas como rizóbios. Estas bactérias apresentam enorme diversidade biológica e funcional, relativamente pouco estudada para um grande número de culturas e sistemas tropicais. Neste contexto, um dos primeiros passos para o estudo da diversidade genética microbiana é o processo de extração de DNA genômico, que deve ser eficiente, fornecendo um DNA de boa qualidade, e, simultaneamente, prático e econômico, para permitir um grande número de análises. A metodologia de extração de DNA poderá influenciar nas reações de PCR para genes específicos e para marcadores moleculares. Tradicionalmente, a metodologia mais aplicada é a que utiliza o fenol, composto químico corrosivo que pode causar severas queimaduras. Portanto, este projeto tem como objetivo a caracterização genética de estirpes rizobianas isoladas de diferentes plantas hospedeiras de interesse agrícola. Para tanto, três protocolos de extração de DNA genômico, alternativos à utilização de fenol, foram avaliados quanto a capacidade de extração de DNA genômico de rizóbios e a influência em reações de PCR para o gene nifH, codificador da enzima nitrogenase. Dez estirpes rizobianas foram selecionadas de uma coleção de 150 amostras para a avaliação dos protocolos. Estas estirpes foram inicialmente esgotadas em placas de Petri com meio sólido TSA 10% (Trypcase Soy Agar) e incubadas a 280C por 72h, para obtenção de colônias isoladas. Em seguida, uma colônia isolada de cada estirpe foi inoculada em meio líquido TSA 10%, incubada a 280C, sob agitação constante (120rpm) por 18h. Após o cultivo em meio líquido, quatro mililitros das culturas foram centrifugadas (13000g), descartado o sobrenadante e o precipitado foi ressuspendido em 500L de TE (10 mM de Tris HCl; 1 mM de EDTA; pH 8,0). Cada linhagem foi processada de forma a fornecer esta resuspensão para os três protocolos de extração de DNA avaliados. Um protocolo utilizou a temperatura como fator principal, o segundo utilizou a temperatura e o SDS (dodecil sulfato de sódio) e o terceiro foi a utilização de um kit comercial da marca Fermentas. Em todos os protocolos, o DNA foi lavado com etanol gelado e dissolvido em água ultrapura. Em seguida, as amostras foram observadas em eletroforese de gel de agarose (0,8%) e fotodocumentadas. Foi possível observar diferenças entre os protocolos, quanto a capacidade de extração de DNA de estirpes rizobianas. As análises estão em processo, sendo o próximo passo a ser realizado a utilização destas amostras em reações de PCR.

Área do Conhecimento: Agronomia

Palavras-chave: método , DNA , rizóbio

Apoio – FACEPE/CNPq

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