Expressão da metaloproteinase 9 no carcinoma de células escamosas oral

 

Expression of matrix metalloproteinase 9 in oral squamous cell carcinoma

 

 

Lianne D'Oleron Lima Vasconcelos^I; Nathalia Vieitez Rodrigues Moreira^I; Leorik Pereira da Silva^II; Ana Paula Veras Sobral^III

^I Graduada em Odontologia, FOP/UPE.
^II Aluno de Graduação em Odontologia, FOP/UPE.
^III Professora Associada de Patologia Bucal da FOP/UPE.

Endereço para correspondência

 

 

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RESUMO

A metaloproteinase-9 (MMP-9) ou gelatinase B pertence à família das metaloproteinases da matriz, enzimas que degradam componentes da matriz extracelular (MEC) e da membrana basal e estão implicadas no processo de carcinogênese, contribuindo para a progressão tumoral, invasão e metástase. Neste trabalho, a MMP-9 foi utilizada como marcador imuno-histoquímico, a fim de correlacionar sua expressão com a gradação histológica de 28 casos de carcinoma de células escamosas oral (CCEO) obtidos do Laboratório de Patologia Bucal da Faculdade de Odontologia de Pernambuco (FOP/UPE). As amostras foram classificadas quanto ao grau de malignidade em carcinoma in situ, baixo grau, grau moderado e alto grau de malignidade. A técnica imuno-histoquímica foi realizada através do método estreptavidina-biotina, utilizando o anticorpo anti-MMP9. Na análise estatística, foi utilizado o teste Exato de Fischer, com nível de significância de p=0.05. Verificou-se que a MMP-9 apresentou positividade em 24 casos (85.7%) de CCEO, sendo observada correlação estatisticamente significativa entre a expressão da MMP-9 e o grau de malignidade (p=0.002). Os resultados indicam que a expressão da MMP-9 pode ser sugerida como fator preditivo de comportamento biológico agressivo no CCEO.

Descritores: Carcinoma de células escamosas. Neoplasias bucais. Imuno-histoquímica. Metaloproteinase 9 da Matriz.

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ABSTRACT

The metalloproteinase-9 (MMP-9) or gelatinase B belongs to the family of matrix metalloproteinases, enzymes which degrade extracellular matrix (ECM) and basement membrane components and are implicated in the carcinogenesis process, contributing to tumor progression, invasion and metastasis. In this work, MMP-9 was used as an immunohistochemical marker in order to correlate its expression with histological grading of 28 cases of oral squamous cell carcinoma (OSCC) obtained from the Laboratory of Oral Pathology, School of Dentistry of Pernambuco (FOP / UPE). The samples were classified according to the malignancy grade as in situ carcinoma, low grade, intermediate grade and high grade of malignancy. The immunohistochemistry technique was performed by the streptavidin-biotin method using the antibody anti-MMP9. The statistical analysis used the Fisher's exact test, with a significance level of p=0.05. It was verified that MMP-9 expression was positive in 24 OSCC cases (85.7%). Significant statistical correlation was observed between the expression of MMP-9 and the degree of malignancy (p=0.002). The results indicate that expression of MMP-9 may be suggested as a predictor of aggressive biological behavior in OSCC.

Descriptors: Carcinoma, Squamous Cell. Mouth Neoplasms. Immunohistochemistry. Matrix Metalloproteinase 9.

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INTRODUÇÃO

A determinação do potencial de crescimento, invasão e metástase é de extrema importância na conduta clínica, no tratamento e no prognóstico do carcinoma de células escamosas (CCE)^1,2. O estroma tumoral tem uma relação direta com o comportamento biológico das neoplasias, contribuindo significativamente para a progressão do CCE³. Para que aconteçam as etapas da carcinogênese (organização primária, progressão, angiogênese, invasão local e desenvolvimento de metástases), a célula neoplásica necessita da degradação proteolítica da matriz extracelular (MEC)⁴. Dentre as enzimas degradadoras da MEC, destaca-se a família das metaloproteinases da matriz (MMPs), diante da sua extensa capacidade de degradar, processar, ativar ou inativar praticamente todos os componentes da MEC^2,5.

As MMPs são uma família de enzimas proteolíticas, do tipo endopeptidases, zinco- e cálcio-dependentes, que atuam desorganizando e degradando componentes da MEC e da membrana basal, através de processos que alteram as interações célula-célula e célula-matriz^2,5. Embora desempenhem várias funções fisiológicas, há grande interesse no potencial das MMPs, livre de mecanismos regulatórios, na propagação do câncer^6,4. Essas ações podem ser diretas, através da degradação da MEC e da membrana basal, promovendo proliferação de células neoplásicas e disseminação metastática, e indiretas, quando promovem angiogênese, necessária para nutrição e disseminação do tumor⁴. O aumento na produção dessas enzimas associa-se ao fenótipo metastático e invasivo em muitos tumores^7,1,3.

Diferentes tipos de MMPs interagem entre si e participam de diversos estágios do desenvolvimento do câncer⁸. Durante a invasão neoplásica, o maior papel das MMPs consiste não apenas na quebra da barreira da MEC, mas no rearranjo dos seus componentes para facilitar a migração celular por entre este microambiente^9,4.

A MMP-9 é a gelatinase B do grupo das gelatinases, assim conhecidas por degradarem os vários tipos de colágenos desnaturados (gelatinas), além de contribuírem para a digestão do colágeno tipo IV e outros componente da membrana basal^2,5.

As MMPs estão implicadas numa variedade de papéis que podem ajudar a iniciação do tumor, crescimento, migração, angiogênese, a seleção de subpopulações resistentes a apoptose, e na invasão e metástase. Portanto, não podem mais ser pensadas apenas como destruidoras da MEC, mas como parte de um distinto sistema de comunicação através do qual o tumor interage com o estroma¹⁰.

Diante do exposto, o objetivo deste trabalho é analisar, através da técnica imuno-histoquímica, a expressão da MMP-9 em carcinomas de células escamosas orais (CCEOs) na tentativa de entender sua correlação com o grau histológico de malignidade destas lesões.

 

METODOLOGIA

Foram obtidas vinte e oito (28) amostras de CCEOs bucais emblocadas em parafina, bem como as fichas de biópsia, no Laboratório de Patologia Bucal da FOP (UPE). Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa desta instituição através do registro 083/10.

A gradação dos tumores foi realizada utilizandose a classificação histopatológica de malignidade proposta pela Organização Mundial de Saúde (OMS, 2005)¹¹, que se baseia no grau de diferenciação celular. Os tumores foram classificados em baixo, moderado e alto grau de malignidade. Considerou-se, ainda, carcinoma in situ quando não houve invasão da membrana basal.

A técnica imuno-histoquímica foi realizada pelo método da estreptavidina-biotina peroxidase, otimizado com o sistema de amplificação LSAB (Labeled Streptavidin-Biotin for mouse primary antibody, DAKO). A recuperação antigênica foi feita em panela de pressão elétrica durante 1' em Citrato pH 6.0; procedeu-se a incubação do anticorpo primário monoclonal anti-MMP9 (DBS), numa diluição de 1:125, sendo a 3,3-diaminobenzidina (Sigma Chemical CO, St. Louis, USA) o cromógeno; os cortes foram contra-corados com Hematoxilina de Harris.

A imunomarcação foi analisada à microscopia de luz, e o padrão de imunoexpressão da MMP-9 foi classificado quanto à presença (+) ou ausência (-), e para os casos positivos em: fraca (+), moderada (++) e intensa (+++), de acordo com a intensidade de marcação.

Foram utilizados o Software STATA/SE 9.0 e o Excel 2007 para realizar a análise estatística. O Teste Exato de Fisher verificou a associação entre as variáveis categóricas, sendo aplicado com 95% de confiança, considerando-se estatisticamente significativo quando p<0,05.

 

RESULTADOS

Dos 28 casos de CCEOs estudados, observouse maior prevalência dos casos de alto grau (n=14; 50%) em relação aos de baixo grau (n=10; 35.7%). Observamos ainda 2 casos de grau moderado e 2 de carcinoma in situ, correspondendo a 7.1% cada.

A análise da imunomarcação da MMP-9 revelou que, dos 28 casos, 24 foram positivos (85.7%); destes, 18 (75%) foram positivos no parênquima, com intensidade fraca em 5 (27.8%), moderada em 9 (50%) e forte em 4 (22.2%). Em 1 caso, foi observada marcação positiva moderada em células do parênquima no front de invasão tumoral. No estroma, 13 casos foram positivos (54.2%), sendo a intensidade fraca em 2 (15.4%), moderada em 7 (53.8%) e forte em 4 (30.8%). A Figura 1 mostra a expressão da MMP-9 em CCEOs investigados.

 

 

 

Todos os casos de alto grau de malignidade (n=14) foram positivos para a MMP-9, observandose associação estatisticamente significativa entre a marcação da MMP-9 e a gradação histológica (p=0.002) (Tabela 1).

 

 

 

DISCUSSÃO

Estimativas do INCA (2012)¹² sugerem aproximadamente 518.510 novos casos de câncer no Brasil para os anos de 2012 e 2013. Para o câncer bucal, são estimados 14.170 novos casos, sendo 9.990 casos em homens e 4.180 em mulheres. Esses elevados valores têm impulsionado estudos que visam um melhor entendimento do processo da carcinogênese, assim como a descoberta de mecanismos que predizem o comportamento biológico destes tumores para que sejam desenvolvidos tratamentos mais efetivos.

Analisando casos de CCEOs, Nascimento (2010)⁵ verificou que os de alto grau de malignidade foram mais frequentes (n=41; 58%) que os de baixo grau (n=30; 42%). Nosso estudo concordou com este resultado, observando-se maior prevalência dos casos de alto grau (50%) em relação aos de baixo grau, grau moderado e carcinoma in situ (35.7%, 7.1% e 7.1%, respectivamente).

A determinação da capacidade de invasão e metástase do CCEO é de extrema importância na conduta clínica, no tratamento e no prognóstico. Para que ocorra essa invasão, são necessárias alterações nas interações entre células neoplásicas e a MEC, ocorrendo um aumento na secreção de enzimas degradadoras da MEC, em especial as MMPs².

Tem-se verificado que, em cânceres humanos, a desregulação da expressão das MMPs ocorre tanto nas células malignas do tumor quanto nas células do estroma^13,5. No presente estudo, houve expressão da MMP-9 em ambos, sendo maior no parênquima (75%) do que no estroma (54.2%), enquanto Nascimento (2010)⁵ encontrou maior expressão no estroma (76%) do que no parênquima (52%).

O-Charoenrat et al. (2001, 2002)^14,15 relataram a expressão das MMPs e de seus inibidores (TIMPs) em CCEs de cabeça e pescoço, verificando que as MMPs-2, -7, -9 e -11 exerceram um importante papel na progressão e desenvolvimento de metástase nos tumores estudados. Hong et al. (2000)¹, comparando a expressão das MMPs-2 e –9 em CCEOs, relataram um maior papel da MMP-9 no desenvolvimento de metástase, afirmando ser sua expressão um bom marcador como fator prognóstico.

Recentes pesquisas^16-19 também tem demonstrado elevada expressão da MMP-9 nos CCEs de cabeça e pescoço, e enfatizado seu importante papel na progressão tumoral, especialmente devido à degradação do colágeno IV, principal componente da membrana basal. Corroborando a literatura citada, o presente estudo obteve expressão significativa da MMP-9 nos CCEOs (85.7%). Além disso, ao correlacionar a marcação da MMP-9 com o grau de malignidade dos casos investigados, verificou-se significância estatística de p=0.002, o que indica uma maior ação proteolítica desta MMP nos tumores com alto grau de malignidade, e consequente aumento no potencial de invasão e metástase, à semelhança do achado de De Vicente et al. (2005)²⁰. Porém, Hong et al. (2000)¹ não verificaram correlação entre a gradação histológica do CCEO e a expressão da MMP-9.

Com base nesses resultados, concluímos que a expressão da MMP-9 pode ser sugerida como fator preditivo de comportamento biológico agressivo no CCEO.

 

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Ana Paula Veras Sobral
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