Atividade antimicrobiana in vitro de uma suspensão de própolis frente ao Enterococcus faecalis
Antimicrobial in vitro activity of a propolis suspension against Enterococcus faecalis
Marcus Vinícius Reis Só*; Márcia Helena Wagner**; Ricardo Abreu da Rosa***; Lucas Telles****; Francisco Colpani****; Sandra Henz*****; Miriam Lago Magro******
* Professor Adjunto de Endodontia da Faculdade de Odontologia, Departamento de Odontologia Conservadora da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil.
** Professora Assistente de Endodontia do curso de Odontologia, Departamento de Enfermagem e Odontologia da Universidade de Santa Cruz do Sul, Santa Cruz do Sul, RS, Brasil.
*** Doutorando do Programa de Pós-Gradação Strito Senso da Faculdade de Odontologia, Departamento de Odontologia Conservadora da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil. ]]>
**** Cirurgião-dentista graduado na Faculdade de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil.
***** Professora Adjunta de Cariologia, Departamento de Odontologia Preventiva e Social da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil.
****** Professora Asisstente de Endodontia, Departamento de Odontologia Restauradora da Faculdade de Odontologia da Univesidade de Passo Fundo, Passo Fundo, RS, Brasil.
RESUMO
Objetivos: O objetivo deste estudo foi avaliar, in vitro, a atividade antimicrobiana da suspensão de própolis a 5 e 10% sobre Enterococcus faecalis (ATCC 29212). Métodos: O teste de difusão em ágar e a técnica do disco foram empregados para as seguintes substâncias: (n = 19) extrato seco de própolis a 5 e 10%, clorexidina (controle positivo) e propilenoglicol (controle negativo). O diâmetro dos halos de inibição bacteriana foi medido após 24 horas. Resultados: Diferenças estatisticamente significantes foram observadas através do teste Anova (1 via) e post hoc de Tukey com nível de significância de 5% (p < 0,001). O grupo da clorexidina mostrou halos de inibição de crescimento bacteriano com média de 6,631 mm, ao passo que a própolis a 5 e 10% e o propilenoglicol não apresentaram halos. Conclusão: O extrato de própolis a 5 e 10% suspenso em propilenoglicol não evidenciou atividade antimicrobiana, in vitro, em comparação com o Enterococcus faecalis.
Palavras-chave: Própolis. Enterococcus faecalis. Endodontia.
ABSTRACT
Objective: the objective of this study is to evaluate in vitro the antimicrobial activity of 5% and 10% propolis suspension against Enterococcus faecalis (ATCC 29212). Methods: The agar diffusion test and the disc method were used for the following substances: (n = 19) propolis dry extract at 5% and 10%, chlorhexidine (positive control) and propylene glycol (negative control). The inhibition halos were measured after 24 hours. Results: Statistically significant differences were observed through the ANOVA (1 via) and Tukey test with 5% of significance level (p < 0.001). The chlorhexidine group showed bacterial growth inhibition halos with average size of 6.631mm, while propolis at 5% and 10% and the propylene glycol groups did not develop halos. Conclusion: The propolis extract suspension at 5% and 10% in propylene glycol did not present antimicrobial activity in vitro against Enterococcus faecalis.
Keywords: Propolis. Enterococcus faecalis. Endodontics.
Introdução
A necessidade de novos materiais que apresentem propriedades biológicas e antimicrobianas, aliada ao grande avanço da fitoterapia nos últimos anos, tem estimulado a avaliação de diferentes substâncias que possuam propriedades terapêuticas para a odontologia1-3. Exemplo desses produtos é a própolis, Casearia sylvestris, uma resina de coloração e consistência variada, produzida pelas abelhas a partir da mistura de substâncias coletadas de diferentes partes das plantas (brotos, botões florais e exsudatos resinosos) com secreções produzidas em seu organismo4. Investigações científicas revelaram efeitos antioxidantes, antibacterianos, antifúngicos, antivirais, anti-inflamatórios, antitumorais e com propriedades imunomoduladoras5.
Koo et al.6 (2000) avaliaram in vitro a atividade antimicrobiana do extrato de própolis a 10% e Arnica montana 10% sobre 15 micro-organismos da microbiota endodôntica, dentre os quais o E. faecalis. A atividade antimicrobiana foi determinada pelo método de difusão em ágar. O extrato de própolis inibiu significativamente todos os micro-organismos testados (p < 0,05), com maiores halos de inibição para o Actinomyces spp.
Groisman et al.7 (2005) avaliaram o efeito da própolis a 1,5 e 3% e da clorexidina 0,06 e 0,12% sobre os micro-organismos salivares. Os autores verificaram que a solução de própolis a 3% associada à clorexidina 0,12% e que as soluções de própolis a 3 e 1,5% associadas à clorexidina 0,06% reduziram o número de Streptococcus sp em 26,7, 25,9 e 24,9% respectivamente (p < 0,01).
]]> Maia Filho et al.8 (2008) compararam a eficácia de três irrigantes empregados em endodontia e o extrato de própolis frente ao Enterococcus faecalis. Foram utilizados o teste de difusão em ágar e as seguintes substâncias: hipoclorito de sódio 5%, gel de clorexidina 2%, hidróxido de cálcio e extrato hidroalcoolico de própolis. O extrato de própolis apresentou uma boa atividade antimicrobiana, sendo maior que o hipoclorito de sódio 5%. Entretanto, o gel de clorexidina foi mais efetivo contra o E. faecalis.Awawdeh et al.9 (2009) compararam a atividade antimicrobiana da própolis e do hidróxido de cálcio, como medicação intracanal, durante um e dois dias, num modelo de dentina infectada com E. faecalis. Cinquenta discos de dentina de 7 mm de comprimento, obtidos de dentes humanos, foram empregados. Desses, 45 foram infectados com E. faecalis e divididos em dois grupos de vinte discos (hidróxido de cálcio ou própolis), cinco foram mantidos estéreis como controle negativo e cinco discos, como controle positivo. Os resultados demonstraram que a própolis foi significativamente mais efetiva do que o hidróxido de cálcio após um curto período de tempo.
Kandaswami et al.10 (2000) investigaram a atividade antimicrobiana da Morinda citrifolia juice, gel de clorexidina 2%, própolis, povidone iodine 2% e hidróxido de cálcio sobre a dentina do canal radicular infectada com E. faecalis, em duas profundidades, 200 e 400 micrometros e em três intervalos de tempo (1, 3 e 5 dias). O número de unidades formadoras de colônia foi estatisticamente significante para todos os grupos quando comparado com o grupo controle (solução salina). O grupo da clorexidina gel apresentou a melhor eficácia antimicrobiana (100%), seguido pelo grupo da povidone iodine (87%), própolis (71%) Morinda juice (69%) e hidróxido de cálcio (55%). Não houve diferença significante entre a Morinda citrifolia juice e a própolis, bem como em relação às duas profundidades.
A instalação de processos infecciosos no sistema de canais radiculares tem como consequência a periodontite apical, sendo o controle dos microorganismos no sistema de canais radiculares um grande desafio do tratamento endodôntico11-12. Para tanto, necessitamos de substâncias que penetrem no sistema de canais e atuem sobre a microbiota endodôntica. O hidróxido de cálcio tem sido escolhido em razão das suas propriedades biológicas e microbiológicas13-15. Entretanto, evidências científicas vêm apontando para a resistência de alguns microorganismos ao hidróxido de cálcio16-17.
Os Enterococcus faecalis são cocos gram-positivos, anaeróbios facultativos, encontrados isolados, aos pares ou em cadeias curtas18. Esse micro-organismo é raramente encontrado em infecções primárias19, mas é a espécie predominante em casos de retratamento endodôntico20-21, chegando a constituir de 38 a 70% da microbiota nesses casos22-23, sendo detectado em vinte de trinta casos de infecções endodônticas persistentes associadas a dentes com canais obturados18. Essa alta prevalência nas complicações pós-tratamento endodôntico é atribuída, de modo especial, à sua capacidade de aderir ao colágeno, potencializada pela presença de soro humano e, no processo de colonização, de invadir os túbulos dentinários, além de interferir nas defesas do hospedeiro e resistir à ação de substâncias antimicrobianas, fazendo de sua colonização uma constante fonte de reinfecção do canal obturado24,13,25.
O presente estudo tem por objetivo avaliar in vitro a atividade antimicrobiana de cepas padrão de Enterococcus faecalis (ATCC 29212) frente à solução de própolis seco veiculado a propilenoglicol nas concentrações de 5 e 10%.
Material e métodos
A metodologia deste trabalho consiste em um estudo experimental, in vitro, controlado e randomizado, realizado no laboratório de Bioquímica e Microbiologia da Faculdade de Odontologia do Rio Grande do Sul, Brasil (Labim).
Procedimentos experimentais
]]> Obtenção das amostras de própolisO extrato seco de própolis foi obtido no estado do Rio Grande do Sul e analisado pelo Laboratório All Chemistry (Certificado: 37542-1). As soluções de própolis a 5 e a 10% suspensas em propilenoglicol foram manipuladas pelo método de levigação no laboratório da farmácia Marcela (Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil).
Preparo do meio
Inicialmente, foram preparados 300 mL de meio de cultura ágar cérebro-coração – BHIA (Becton Dickinson and Co. Franklin Lakes, New Jersey, EUA), utilizando-se água destilada como solvente. A seguir, o meio preparado foi esterilizado e, após resfriamento até a temperatura de 50 °C, transferido para 19 placas de Petri (150 x 10mm) esterilizadas. Cada placa recebeu 15 mL de meio de cultura, ficando com uma espessura de 2 mm. Posteriormente, as placas foram levadas à capela de fluxo laminar, em temperatura ambiente, até ocorrer o completo resfriamento do meio de cultura.
Micro-organismo utilizado
O Enterococcus faecalis foi obtido a partir de cepas padrão (ATCC 29212) e foi previamente semeado em uma placa de Petri, contendo BHIA. Após, com uma alça de platina, o micro-organismo foi semeado em um tubo contendo 10 mL de caldo de soja tryptcase – TSB (HIMEDIA, Mumbai – Índia). Este tubo foi levado à estufa de cultura e incubado por um período de 24 horas a 37 °C.
Passado esse período, suspensões bacterianas ajustadas de acordo com a turbidez do tubo número 1 da escala de Mac Farland foram obtidas diluindose as colônias bacterianas, crescidas no BHIA, em 20 mL de água destilada.
Processo de inoculação do meio
A seguir, uma alíquota de 1,0 mL da suspensão microbiana foi transferida para cada uma das 19 placas de Petri, contendo meio de cultura. A suspensão foi semeada em toda superfície do meio de cultura com o auxílio de um swab, de modo a se obter um crescimento confluente.
Técnica do disco – difusão em ágar
]]> Na superfície do meio de cultura inoculado de cada uma das 19 placas foram colocados quatro discos de papel filtro de um centímetro de diâmetro, previamente confeccionados e esterilizados no Laboratório de Microbiologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Antes de serem levados à superfície do meio de cultura, os discos foram embebidos durante o período mínimo de 1min em 1 mL de cada uma das substâncias em estudo (n = 19): C+ (controle positivo): solução de clorexidina a 2%; C- (controle negativo): propilenoglicol; S1: solução de própolis a 5%; S2: solução de própolis a 10%.Pré-incubação e incubação
As placas de Petri foram pré-incubadas em temperatura ambiente por 1 hora, a fim de permitir a difusão das substâncias antes do desenvolvimento microbiano. A seguir, foram incubadas a 37 °C por 24 horas em microaerofilia. Decorrido o período de incubação, com o auxílio de uma régua milimetrada e uma boa fonte de luz refletida, foi realizada a mensuração do diâmetro da zona de inibição do crescimento microbiano ao redor de cada um dos discos. Foram realizadas duas medidas por dois examinadores diferentes. A média de ambas foi calculada e utilizada para fins de análise dos resultados.
Interpretação dos resultados
As medidas dos halos de inibição de crescimento bacteriano dos grupos experimentais foram analisadas pela análise da variância (1 via) e teste de Tukey com nível de significância de 5%. Os dados foram analisados e processados com o auxílio do programa SPSS (Statistical Package for the Social Science) versão 3.0.
Resultados
Os resultados do presente estudo demonstram diferença estatisticamente significante entre a clorexidina a 2% (controle positivo) e os demais grupos experimentais (Tab. 1).
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O grupo da clorexidina mostrou halos de inibição de crescimento bacteriano com média de 6,631 mm, ao passo que a própolis a 5 e 10% e o propilenoglicol (controle negativo) não apresentaram halos (p < 0,001).
Discussão
Em endodontia, no tratamento de dentes com canais infectados, a preocupação em diminuir a população de micro-organismos, promovendo a sanificação do sistema de canais radiculares, é motivo de inquietantes pesquisas no campo da microbiologia endodôntica.
O hipoclorito de sódio e a clorexidina, durante o preparo biomecânico, a pasta de hidróxido de cálcio em suas diferentes veiculações, como curativo de demora, são exemplos de substâncias que venceram a barreira do tempo e são empregadas com o intuito de combater as infecções endodônticas. Cada uma tem a sua devida importância. Entretanto, a busca por uma substância ideal, com a qual se consiga uma maior efetividade sobre os micro-organismos endodontopáticos e, ao mesmo tempo, apresente biocompatibilidade e não citotoxicidade, norteia as pesquisas da comunidade científica.
A escolha do Enterococcus faecalis justifica-se em razão de ser um micro-organismo que compõe a microbiota endodôntica, principalmente relacionado aos casos de insucessos endodônticos, nos quais lesões refratárias ao tratamento não reparam pela terapia endodôntica convencional. Esse micro-organismo gram-positivo e anaeróbio facultativo tem demonstrado tolerar níveis de pH elevados (acima de 12), suportando o mecanismo de ação do hidróxido de cálcio até mesmo quando em contato direto12,25-27.
O teste de difusão em meio sólido é uma técnica consagrada para avaliar a atividade antibacteriana de determinada substância. Entretanto, há de se considerar as limitações que apresenta, entre as quais se pode citar a sua incapacidade de fornecer condições de igualdade para se comparar substâncias com solubilidade e difusibilidade distintas28. Além disso, a presença de enzimas bacterianas, a composição do meio, a densidade do inóculo, o tempo de incubação, a temperatura e a estabilidade do medicamento são fatores que influenciam em resultados conflitantes.
]]> Considerando que o teste de difusão em ágar é mais eficiente para as substâncias solúveis em água, neste estudo se empregou o extrato seco de própolis suspenso em propilenoglicol. Assim, é possível fazer-se a ligação de que, sendo o propilenoglicol hidrossolúvel, a utilização do teste de difusão em ágar pode ser justificada.Um aspecto que merece atenção é a presença de estudos que veiculam a própolis em substâncias como o etanol a 70 ou 80%6,8, clorexidina a 0,06 e 0,12%7. A opção pelo propilenoglicol justificou-se pelo interesse em estudar apenas a ação da própolis frente ao E. faecalis, evitando qualquer tipo de alteração na atividade deste.
Os resultados obtidos para o extrato seco de própolis a 5 e 10% com ausência de halos de inibição mostraram a falta de ação destes sobre o E. faecalis. Esse fato permite questionarmos o emprego dessas substâncias nas situações clínicas em que ocorre a viabilidade desse micro-organismo. Por outro lado, estudos de Awawdeh et al.9 (2009) e Kandaswami et al.10 (2010) demonstraram resultados de boa eficácia antimicrobiana para a própolis. Entretanto, os estudos citados foram realizados ex vivo, em dentina infectada com E. faecalis, não podendo ser confrontados com o presente trabalho em razão das diferenças metodológicas.
Os resultados do presente estudo também diferem dos obtidos por Koo et al.6 (2000) e Maia Filho et al.8 (2008), os quais encontraram atividade antimicrobiana para o extrato de própolis frente ao E. faecalis. Explicações para essas diferenças podem estar relacionadas ao veículo. A maioria dos estudos emprega extrato hidroalcoolico, ao passo que o presente estudo optou pelo emprego do propilenoglicol, substância desprovida de qualquer atividade antibacteriana.
Entretanto, a não produção de halos de inibição nem sempre pode significar que as substâncias não apresentam atividade antibacteriana, pois podem não apresentar boa difusão em ágar. Isso pode ocorrer pelo fato de os meios de cultura apresentarem substâncias tamponadoras. Assim, mesmo que sofram difusão, essa pode ser lenta em razão da baixa solubilidade da substância, o que faz com que os níveis de pH alcançados pelo meio não sejam elevados o suficiente para apresentar atividade antimicrobiana29.
Esse foi o primeiro estudo que empregou a própolis suspensa em propilenoglicol, sendo necessário compreender melhor o comportamento dessa substância nesse veículo. A própolis é uma substância não solúvel em água, fato que explica a confecção de uma suspensão através do processo de levigação, onde se colocou a própolis em um gral e, aos poucos, foi adicionado o propilenoglicol, levigando a própolis nesse veículo e gerando uma suspensão facilmente dispersível. Para avaliar a veracidade dos resultados torna-se importante o emprego de outras metodologias, como os testes que apresentam meio de cultura líquido, por oferecerem maiores condições de igualdade para substâncias que possam apresentar dificuldades de dissociação e difusão em ágar.
Outro ponto que deve ser ressaltado é a diversidade dos componentes presentes em cada amostra de própolis. Alguns estão presentes em todas as amostras, ao passo que outros ocorrem somente em própolis colhidas de espécies de determinadas plantas e regiões. Pelo menos duzentos componentes diferentes já foram identificados em amostras de própolis de origens diversas, dentre os quais ácidos graxos e fenólicos, ésteres, ésteres fenólicos, flavonoides, terpenos, esteroides, aldeídos e álcoois aromáticos, sesquiterpenos e naftalina30. A atividade antimicrobiana possui maior ou menor efeito mediante os componentes químicos, o gênero da abelha coletora e os meios de preparo da própolis31. Essa constatação pode explicar a discrepância de resultados entre estudos de semelhante metodologia.
Conclusão
Com base na metodologia empregada e nos resultados obtidos, é lícito concluir que o extrato de própolis a 5 e 10% suspenso em propilenoglicol não evidenciou atividade antimicrobiana, in vitro, frente ao Enterococcus faecalis.
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