Ação antibacteriana de Rosmarinus officinalis L. e Maytenus ilicifolia Mart. sobre bactérias orais

Antibacterial activity of Rosmarinus officinalis L. and Maytenus ilicifolia Mart. on oral bacteria

Julio Cesar Campos Ferreira Filho ^I; Isabella Lima Arrais Ribeiro ^II; Julia Medeiros Martins ^III; Lucas Pereira Borges ^III; Ana Maria Gondim Valença ^IV

^I Mestrado em Odontologia, área de concentração em Odontopediatria, Universidade Federal do Rio de Janeiro, RJ, Brasil
^II Doutora em Modelos de Decisão e Saúde, Universidade Federal da Paraíba, PB, Brasil
^III Graduando(a) em Odontologia, Universidade Federal da Paraíba, PB, Brasil ]]> ^IV Doutora, professora titular, Universidade Federal da Paraíba, PB, Brasil

Endereço para correspondência

Resumo

Objetivo: avaliar a atividade antibacteriana in vitro das tinturas hidroalcoólicas das folhas de alecrim (Rosmarinus officinalis L.) e espinheira-santa (Maytenus ilicifolia Mart.) contra as bactérias bucais. Materiais e método: as bactérias utilizadas no estudo foram Streptococcus mutans (ATCC 25175), Streptococcus oralis (ATCC 10557), Streptococcus salivarius (ATCC 9758), Enterococcus faecalis (ATCC 29212) e Eikenella corrodens (ATCC 23834). Efetivou-se a diluição das tinturas desde 1:1 (forma pura) até 1:64 em álcool 70%, que está presente na fórmula das tinturas fitoterápicas. Água destilada e álcool 70% foram escolhidos como controles negativos, e clorexidina 0,12% como o positivo. As cepas foram reativadas em ágar Brain Heart Infusion (BHI) e semeadas em ágar sangue com BHI. Os testes de sensibilidade foram realizados e as amostras foram incubadas em microaerofilia (37°C) durante 48 horas. O estudo foi realizado em duplicata e os halos foram mensurados com o auxílio de um paquímetro manual e contabilizados por média. Resultados: o controle positivo apresentou halos que variaram de 15 mm a 19 mm, a tintura de Maytenus ilicifolia não apresentou atividade antibacteriana nos organismos testados neste estudo, e a tintura de Rosmarinus officinalis L. obteve halos de inibição até 1:16 em S. mutans (7 mm) e 1:8 para E. faecalis (7 mm). Conclusão: a tintura de alecrim apresentou atividade antibacteriana para as cepas de Streptococcus mutans e Enterococcus faecalis, não foi constatado esse efeito para a tintura de espinheira-santa sobre as linhagens testadas no estudo.

Abstract

Objective: To assess in vitro antibacterial activity of hydroalcoholic tinctures from leaves of rosemary (Rosmarinus officinalis L.) and espinheira-santa (Maytenus ilicifolia Mart.) on oral bacteria. Materials and Method: Streptococcus mutans (ATCC 25175), Streptococcus oralis (ATCC 10557), Streptococcus salivarius (ATCC 9758), Enterococcus faecalis (ATCC 29212), and Eikenella corrodens (ATCC 23834) were the bacterial strains used in this study. The dilution of tinctures was performed, from 1:1 (pure form) up to 1:64 in 70% alcohol, which is present in the formula of phytotherapeutic tinctures. Distilled water and 70% alcohol were selected as negative controls, and 0.12% chlorhexidine as positive control. The strains were reactivated in Brain Heart Infusion (BHI) agar and sowed in blood agar with BHI. Susceptibility tests were performed and samples were incubated in microaerophilia (37°C) for 48 h. The study was performed in duplicate, the halos were measured with the aid of a manual caliper, and scores were recorded as mean. Results: The positive control showed inhibition halos ranging from 15 to 19 mm, the Maytenus ilicifolia tincture did not show antibacterial activity on the organisms tested in this study, and the Rosmarinus officinalis L. tincture obtained inhibition halos of up to 1:16 in S. mutans (7 mm) and 1:8 in E. faecalis (7 mm). Conclusion: Rosemary tincture showed antibacterial activity on Streptococcus mutans and Enterococcus faecalis strains, although the same was not true for espinheira-santa tincture on the strains tested in the study.

Keywords: Microbiology. Phytotherapy. Anti-Bacterial Agent.

Introdução

Nas últimas décadas, o interesse pela fitoterapia aumentou consideravelmente entre usuários, pesquisadores e serviços de saúde¹. O processo de reconhecimento científico mundial da utilização de medicamentos fitoterápicos é antigo, e desde a Declaração de Alma-Ata, em 1978, tem expressado a sua posição a respeito da necessidade de valorizar a utilização de plantas medicinais no âmbito sanitário e na atenção básica à saúde². Nessa declaração, a Organização Mundial da Saúde reconhece que 80% da população dos países em desenvolvimento utilizam práticas tradicionais nos seus cuidados básicos de saúde, e 85% usam plantas medicinais ou preparações dessas¹.

Portanto, trabalhos que visem à utilização de fitofármacos ou produtos medicinais à base de partes de plantas merecem destaque no âmbito social e científico, pela potencialidade de subsidiar tratamentos de diferentes agravos existentes nas mais diversas áreas da saúde. Avaliar a atividade antimicrobiana surge como teste para verificar a hipótese de ação de produtos fitoterápicos para a realização de testes posteriores mais específicos e precisos³.

Extratos e tinturas de Rosmarinus officinalis L. apresentam ainda propriedades importantes, como ação de proteção hepática⁸, antidiabética⁹, antiulcerosa¹⁰ e efeitos antidepressivos¹¹. Estudos detalhados sobre a sua composição afirmam que os principais compostos antioxidantes identificados são ácido carnósico, carnosol, abietanos diterpenos, ácido rosmarínico e éster ácido hidroxicinâmico¹². É relatado que essa planta tem grande quantidade de compostos fenólicos e elevada atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, devido à ação do ácido carnósico e do carnosol¹³. No entanto, as atividades antimicrobianas não foram profundamente caracterizadas e mensuradas¹⁴.

Maytenus ilicifolia Mart. é pertencente à Celastraceæ, uma família pantropical nativa da região sul do Brasil, Paraguai, Uruguai e norte da Argentina. A planta é um pequeno arbusto medicinal que cresce a uma altura de até 5 metros, com folhas e frutos que se assemelham aos do azevinho. É popularmente conhecida como espinheira-santa (holy spine), cancerosa, cangorosa, maiteno e espinheira divina (divine spine)¹⁵.

A espinheira-santa é amplamente empregada na medicina tradicional em muitos países da América do Sul, suas folhas são comumente utilizadas como remédio para doenças gastrointestinais, incluindo dispepsia e úlceras gástricas¹⁶. Remédios com essa planta são encontrados no comércio local, com apresentação em cápsulas, pós, folhas secas, ou como preparações aquosas ou aquoso-alcoólicas. Ao analisar a composição química, a comprovada presença de metabólitos fenólicos, tais como taninos condensados, flavonoides e triterpenos¹⁶, poderia justificar o uso de algumas espécies de Maytenus como medicamento anti-inflamatório e no combate a úlceras. Essas funções são corroboradas cientificamente e abrem espaço para a utilização dessa tintura para esses agravos. Quanto à atividade antiulcerogênica, destaca-se a ação de proteção semelhante à observada com a cimetidina, um reconhecido antagonista do receptor da histamina¹⁶.

Portanto, devido às importantes atividades promovidas pelas plantas alecrim (Rosmarinus officinalis L.) e espinheira-santa (Maytenus ilicifolia Mart.), este estudo justifica-se por complementar a literatura científica atual ao testar a ação dessas plantas sobre bactérias orais de diferentes grupos nos quais a atividade antibacteriana é pouco ou não é relatada. Nessa perspectiva, objetivou-se avaliar a atividade inibitória em bactérias in vitro das tinturas de alecrim (Rosmarinus officinalis L.) e espinheira-santa (Maytenus ilicifolia Mart.) contra as cepas comumente encontradas em meio bucal, Streptococcus mutans (ATCC 25175), Streptococcus oralis (ATCC 0557), Streptococcus salivarius (ATCC 9758), Enterococcus faecalis (ATCC 29212) e Eikenella corrodens (ATCC 23834).

Materiais e método

Trata-se de um estudo com técnica de documentação direta laboratorial e com procedimento estatístico descritivo.

As tinturas hidroalcoólicas de alecrim (Rosmarinus officinalis L.) e espinheira-santa (Maytenus ilicifolia Mart.) foram adquiridas em uma farmácia de manipulação fitoterápica na cidade de João Pessoa, PB. Ao analisar o laudo técnico, verificou-se que as formulações se encontram comercialmente com uma diluição prévia industrial de 20% em álcool 70%. Tal concentração, incialmente já diluída em 20%, foi adotada como a concentração pura neste estudo. Portanto, para evitar possíveis vieses nos resultados, optou-se por adotar o álcool 70% como um dos controles negativos do estudo. Efetivou-se a diluição das tinturas desde 1:1 (forma pura) até 1:64 (D6 – sexta diluição) em álcool 70%, por estar presente na formulação prévia das tinturas fitoterápicas.

Outro controle negativo utilizado foi a água destilada, que é comprovadamente ineficaz no combate químico às bactérias. Como controle positivo foi utilizado o digluconato de clorexidina 0,12% sem álcool (Periogard®), por ter uma concentração ótima para a cavidade bucal.

A escala 0,5 de McFarland (1,5 x 108 micro-organismos/ mL) foi adotada para a preparação dos inóculos, que foram diluídos até atingir a concentração de 5 x 106 micro-organismos/mL. A semeadura de 50 μl dos micro-organismos foi realizada homogeneamente em cada placa de Petri com auxílio de swabs descartáveis. O teste de susceptibilidade foi realizado utilizando o método de difusão em ágar e as placas com inóculo foram incubadas a 37°C, em microaerofilia, por 48 horas.

Para a difusão em ágar, foram realizados poços com ponteiras estéreis e inserido em cada 50 μl da substância teste. O estudo foi realizado em duplicata e os halos de inibição foram mensurados com o auxílio de um paquímetro manual. Os escores finais foram obtidos pela média do diâmetro (em milímetros) dos halos de inibição de crescimento bacteriano e os dados foram analisados descritivamente.

Resultados

Rosmarinus officinalis L. foi a única planta que promoveu atividade antibacteriana sobre as cepas de Streptococcus mutans e Eikenella corrodens, com halos de inibição até a concentração de 14,0625 mg/ mL (7 mm). Em S. salivarius e E. faecalis, foi encontrada ação antimicrobiana semelhante, com formação de halos médios de 7 mm de diâmetro na concentração de 14,0625 mg/mL. Em S. oralis, a ação realizada ocorreu até a diluição de 1:8 (112,5 mg/ mL), com uma média de halos de inibição de 7 mm.

Os controles negativos (álcool 70% e água destilada) não influenciaram no crescimento bacteriano, e o controle positivo apresentou os maiores halos de inibição, destacando-se halos de 19 mm para Streptococcus oralis (Tabela 1).

Maytenus ilicifolia Mart. obteve uma atividade mais discreta e destacou-se por impedir o crescimento bacteriano até a concentração de 112,5 mg/ mL, com um halo médio de 7,5 mm para E. faecalis. Para S. oralis e salivarius, a atividade encontrada ocorreu até 225 mg/mL, promovendo a formação de halos médios de 7 mm de diâmetro.

Discussão

Os testes com agentes antimicrobianos sobre bactérias orais planctônicas podem qualificar o agente para tratamento de infecções orais biofilme-dependentes ou desqualificá-lo, caso esses testes demonstrem resultados negativos¹⁷. Assim, este estudo foi desenvolvido em razão dos poucos estudos existentes na literatura que avaliam a ação antibacteriana das tinturas hidroalcoólicas de Rosmarinus officinalis e de Maytenus ilicifolia sobre bactérias bucais.

Para as análises, foi empregado o álcool 70% como controle negativo devido à substância estar presente na composição das tinturas hidroalcoólicas. É importante destacar que, devido à resistência bacteriana ao álcool, o efeito antimicrobiano das tinturas analisadas no presente estudo não foi influenciado pelo veículo utilizado na sua fabricação. Essa constatação decorre da ausência de atividade bacteriana do álcool 70%, que é corroborada em estudo anterior³. A atividade encontrada com a tintura de Rosmarinus officinalis L. é considerada reduzida, pois apresentou diâmetro máximo dos halos de inibição de apenas 9 mm, 8 mm em sua forma pura (1:1), e ação até 1:16 e 1:8 (ambos com 7 mm) para Streptococcus mutans e Enterococcus faecalis, respectivamente. Considerando o desenho metodológico do estudo, constatou-se que a ação antibacteriana da tintura mostrou-se inferior à registrada para o digluconato de clorexidina 0,12% (que atingiu diâmetros máximos de 19 mm em sua forma pura comercial). Esses achados apontam que a tintura de Rosmarinus officinalis apresenta fraca atividade bacteriana sobre as cepas em teste.

Os resultados dos estudos laboratoriais podem não refletir o efeito real de um material quando aplicado em uma condição in vivo¹⁸. Portanto, os dados obtidos não devem ser extrapolados para uma situação clínica por vários motivos, como diluição do composto em saliva, pH bucal, temperatura, além do fato de que o estudo abrange bactérias isoladamente, diferentemente da condição bucal em que o biofilme apresenta cadeia complexa de micro-organismos. Com base nos resultados obtidos, que comprovam a fraca atividade da tintura de Maytenus ilicifolia, estudos complementares e ensaios clínicos com esse produto mostram-se pouco promissores. Todavia, ressalta-se que a parte utilizada para a tintura é a folha, sendo, portanto, arriscado afirmar que toda a planta não apresenta atividade antibacteriana contra as bactérias estudadas.

Além disso, óleos essenciais, extratos e tinturas de alecrim apresentam elevada diferença em suas atividades antimicrobiana e antioxidante. Essas disparidades são associadas com a composição química e com as variações da própria espécie¹³. Certos fatores, como local de origem¹⁹, ambiente e condições agronômicas²⁰, período da colheita²¹, estágio de desenvolvimento das plantas²² e método de extração²³, influenciam a eficácia dessas propriedades e podem explicar a reduzida atividade antibacteriana da tintura de Rosmarinus officinalis L. e da ausência de atividade de Maytenus ilicifolia Mart.

Em estudo que avaliou os quimiotipos da Rosmarinus officinalis L., a atividade antibacteriana foi evidente contra bactérias encontradas comumente em alimentos e que podem ocasionar infecções e problemas enterais, como Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella typhimurium e Listeria monocytogenes²⁴. Este estudo ainda indica que o quimiotipo, que é uma variação biológica de uma planta ocasionada por fatores externos, como luz solar, calor, temperatura ou condições meteorológicas, é determinante para a atividade antibacteriana, existindo a necessidade de definir e isolar que quimiotipo ou ordem de abundância dos componentes ativos seriam responsáveis pela obtenção de melhores escores de atividade antimicrobiana.

Há ainda evidência de atividade antibacteriana do alecrim contra o Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa²⁵ e espécies de Listeria (ivanovii, monocytogenes, grayi, innocua e monocytogenes, essa em oito subtipos)¹⁴, além dessas, há ação antifúngica em Candida albicans e Aspergillus niger²⁵. Em estudo anterior, avaliou-se uma possível atividade diante de outras importantes bactérias do biofilme oral: Streptococcus mutans, Lactobaccilus casei (ação até 1:4 com 11 mm), S. sanguinis, S. sobrinus (halos de 15 mm, para ambas, apenas na solução 1:1) e S. mitis (sem ação inibitória)²⁶. O atual estudo demostrou maior efetividade residual diante de S. mutans, pois o alecrim expressou ação até 1:16 (7 mm).

Escassos são os estudos científicos na literatura que abordam a atividade antibacteriana da tintura de Maytenus ilicifolia sobre bactérias presentes na cavidade oral. Em adição, diferentes são as metodologias laboratoriais utilizadas, o que dificulta a comparação entre os resultados obtidos, indicando a necessidade de estudos posteriores que comprovem ou refutem os achados registrados no presente trabalho. Em estudo realizado com Streptococcus mutans, S. oralis, S. mitis e Staphylococcus aureus, coletadas de cães e semeadas em meios de cultura, foi encontrada ação antimicrobiana. No entanto, devido às consideráveis diferenças entre bactérias orais da mesma espécie presentes em cães e em humanos, torna-se temerária a comparação com os resultados encontrados neste estudo²⁷.

Em complementação, resultados distintos, embora incomuns, podem ocorrer devido a interferências externas que podem incidir sobre as plantas, como a região geográfica de origem e o processo de formulação das tinturas e estocagem. Contudo, essas condições não comprometem o estudo, pois os fatores anteriormente elencados não são passíveis de controle, optando-se, no presente estudo, pela utilização de uma formulação pronta, acompanhada do respectivo laudo técnico.

Diante do exposto, embora estudos in vitro sofram críticas por apresentarem resultados potencialmente superestimados devido às condições ideais de crescimento bacteriano e de ação da substância a ser testada (não há influência de fatores externos como pH, saliva, temperaturas instáveis, dentre outras características presentes na cavidade oral), eles orientam o desenvolvimento de posteriores estudos clínicos contribuindo para a definição de quais substâncias, compostos ou formulações apresentam potencial ação antibacteriana.

Conclusão

A tintura fitoterápica de alecrim (Rosmarinus officinalis L.) apresentou fraca atividade antibacteriana em amostras de Streptococcus mutans e Enterococcus faecalis, não sendo constatado esse efeito para a tintura de espinheira-santa (Maytenus ilicifolia) sobre as linhagens testadas no estudo.

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Recebido: 16/09/15
Aceito: 04/01/16