Engenharia tecidual de cartilagem articular com ênfase em odontologia

Articular cartilage tissue engineering with emphasis in dentistry

Estela Fernandes e Silva ^I; Karine Laste Macagnan ^I; Camila Perelló Ferrúa ^II; Rafaely Ferreira Severo ^I; Flávio Fernando Demarco ^III; Fernanda Nedel ^IV

^I Graduandas, Centro de Biotecnologia, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, RS, Brasil
^II Doutoranda do Programa de Pós-graduação em Saúde e Comportamento, Universidade Católica de Pelotas, Pelotas, RS, Brasil
^III Professor, Programa de Pós-graduação em Odontologia, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, RS, Brasil ]]> ^IV Professora, Programa de Pós-graduação em Saúde e Comportamento, Universidade Católica de Pelotas, Pelotas, RS, Brasil

Endereço para correspondência

Resumo

Palavras-chave: Condrócitos. Osteoartrite. Regeneração. Engenharia tecidual. Células-tronco.

Abstract

Objective: To review the literature regarding sources of cells, scaffolds, and morphogenic agents currently used to produce articular cartilage. In addition, to address the main challenges for the production of functional cartilage: mechanical and lubricant properties. Literature review: The articular cartilage is a highly specialized tissue that reduces joint friction and distributes forces related to high mechanical loads between bone ends. Thus, trauma and certain inflammatory diseases that affect the articular cartilage may severely compromise quality of life, causing pain and disability. In this context, tissue engineering is an emerging and multidisciplinary field, which three main components are responsive cells, scaffolds, and morphogenic agents. Final considerations: Current treatments for articular cartilage repair have major limitations. Accordingly, tissue engineering could overcome these limitations by producing in vitro cartilage substitutes. However, the triad components - stem cells, morphogenic agents, and scaffolds - need further improvement before clinical application. Moreover, one should consider the application of mechanical stimuli and surface properties to produce an articular cartilage with satisfactory characteristics for in vivo application.

Keywords: Chondrocytes. Osteoarthritis. Regeneration. Tissue engineering. Stem cells.

Revisão de literatura

Biologia da cartilagem articular

A MEC é composta, principalmente, por colágeno do tipo II, o que proporciona resistência à tração³, enquanto os proteoglicanos proporcionam resistência à compressão⁴. Subunidades proteoglicanos são chamados glicosaminoglicanos (GAGs), que formam as moléculas maiores chamadas agrecana⁵. Os condrócitos localizam-se em lacunas no interior da cartilagem e sintetizam os compostos necessários à manutenção da MEC, além de a estabilizarem.A MEC está organizada em quatro zonas: superficial, média, profunda e calcificada. A organização em zonas específicas bem como a nanoarquitetura da MEC contribuem para geração das propriedades viscoelásticas⁶.

A nutrição dos condrócitos dá-se por meio de uma barreira de difusão, em condições de anaerobiose⁴. Devido à natureza avascular desse tecido, a nutrição ocorre por meio da difusão de substâncias oriundas dos capilares do tecido conjuntivo fibroso que envolve todo tecido cartilaginoso, chamada pericôndrio.

No tecido cartilaginoso adulto normal, para manter uma condição estável da matriz, faz-se necessária a regulação do ambiente interno. O balanceamento acontece por meio de diversos fatores de crescimento, de forma que não ocorra ganho ou perda de tecido. Dentre os fatores de crescimento envolvidos podem ser citados dois deveras relevantes, o fator de crescimento semelhante à insulina-1 (IGF- 1) e o fator de transformação de crescimento-beta (TGF-b). Ambos estimulam a síntese de agrecana e de colágeno; além das citocinas como interleucina-1 (IL-1), a interleucina-6 (IL-6) e o fator de necrose tumoral alfa

Lesões e tratamentos

Haja vista que o tecido cartilaginoso articular é responsável por absorver impactos mecânicos, as lesões que acometem essa estrutura podem agregar aspectos negativos quanto à qualidade de vida dos pacientes. Essas lesões podem se desenvolver a partir da prática esportiva, de acidentes automobilísticos ou por outros traumas. Além disso, a cartilagem articular também pode ser acometida por doenças inflamatórias reumáticas que afetam pessoas de todas as idades e sexos, com causas e cura ainda desconhecidas^8,9.

Uma das mais relevantes doenças inflamatórias reumáticas é a osteoartrite (OA), que afeta mais de 200 milhões de pessoas em todo o mundo, só na Europa, 350.000 cirurgias artroscópicas são realizadas anualmente¹⁰. Nota-se, assim, que qualquer agente causador de danos à cartilagem articular é deveras importante e deve ser excluído ou minimizado, uma vez que, devido à sua natureza avascular, o tecido cartilagino tem regeneração limitada^11,12.

Nesse âmbito, inúmeros tratamentos visam contornar o comprometimento da cartilagem articular. Dentre as opções de tratamento, tem-se como alternativa a substiuição do tecido cartilaginoso lesado por um tecido autógeno, trata-se de uma técnica promissora por evitar rejeição imunológica e transmissão de doenças. Contudo, esses tratamentos podem apresentar limitações, como a baixa resistência mecânica do tecido substituinte.

Existem outras opções para sanar ou minimizar as complicações que afetam tecidos cartilaginosos, como o aloenxerto e o xenoenxerto, esse em menor grau, devido à limitação da imunogenicidade, que pode levar à imunorrejeição. Dessa forma, muitos tratamentos são paleativos e restringem-se à eliminação da dor. Assim, o "padrão-ouro" no tratamento continua sendo a substituição total da articulação, que, embora bem sucedida, tem uma vida útil de aproximadamente dez a quinze anos.

Logo, a grande incidência e o carácter nocivo da degeneração de cartilagem mostram-se como indicadores para o desenvolvimento da engenharia de tecidos (ET)^13,14. Portanto, a presente revisão irá abordar as principais fontes de células, tipos de scaffolds e agentes morfogênicos pesquisados na atualidade para o desenvolvimento de cartilagem a partir da ET. Finalmente, abordará os principais desafios para geração de cartilagens funcionais: propriedades mecânicas e lubrificantes.

A engenharia de tecidos trata-se de um novo campo da ciência, que tem como objetivo reconstruir ou restaurar tecidos vivos. Devido ao seu caráter multidisciplinar, faz-se necessário sumarizar sua complexidade por meio de uma tríade, que contém elementos básicos que atuam como pilares para a geração dos tecidos biológicos: células responsivas, scaffolds e agentes morfogênicos⁵.

No entanto, sem o aporte sanguíneo, um tecido criado pela ET, poderá apresentar dificuldades no seu desenvolvimento no sítio de reparo. A vascularização é de suma importância, visto que é responsável pelo abastecimento das células com O2 e nutrientes, e excreção de CO2 e outros metabólitos. Possibilita a sobrevivência, a funcionalidade, a organização estrutural e a interação entre tecido recém- formado e área lesada¹⁵.

Para o sucesso da ET, a grande maioria dos tecidos do organismo depende de um sistema de vasos sanguíneos ramificados, com distanciamento ideal menor que 200 μm. Todavia, a cartilagem bem como a córnea e a pele são tecidos que podem ser suplementados com nutrientes e O2 advindos de uma rede de vasos sanguíneos próximos por meio de difusão, justificando assim o possível sucesso da ET em áreas de reconstrução em pele e cartilagem¹⁶.

Células responsivas

Células responsivas são células sensíveis à sinalização que podem ser obtidas a partir de abordagens básicas. Um dos métodos de obtenção é o modo autólogo, no qual, por meio de uma biopsia, obtêm-se células órgão-específicas. Essa técnica se aplica à maioria dos órgãos, contudo, para alguns tecidos ou órgãos, como válvulas cardíacas, a biópsia direta não é uma alternativa viável.

Existe, contudo, outra opção para a obtenção de células responsivas, que consiste no isolamento de células-tronco embrionárias ou adultas, uma vez que elas têm a capacidade de diferenciar-se em diversos tipos celulares. Todavia, deve-se compreender o correto mecanismo de indução à diferenciação e controle para o tipo de célula desejável. Ainda, a utilização de célula-tronco embrionária encontra limitações éticas devido à utilização das células da massa interna do blastocisto, que leva à destruição do blastocisto e, por conseguinte, à incapacidade de gerar vida¹⁵.

Dessa forma, pesquisas recentes focam-se na obtenção de células-tronco adultas, como as do tecido pulpar de dentes decíduos¹⁷ e permanentes¹⁸, no entanto, sabe-se que essas não são as únicas fontes dentro da cavidade bucal. Podem-se encontrar também células-tronco no ligamento periodontal¹⁹ e na papila apical de dentes não totalmente desenvolvidos²⁰.

Também na tentativa de contornar questões éticas acerca da utilização de embriões humanos e problemas relacionados à imunorrejeição, as células-tronco pluripotentes induzidas (CTPIs) foram desenvolvidas. A geração dessas células baseia-se na transformação de células diferenciadas em células-tronco semelhantes a células embrionárias por meio da inserção de uma série de fatores de transcrição no genoma, a fim de converter o estado transcricional e epigenético em um estado de pluripotência²¹.

Scaffolds

Agentes morfogênicos

Os agentes morfogênicos, também chamados de fatores de crescimento, são proteínas solúveis que atuam na proliferação celular, síntese de matriz e diferenciação tecidual. Eles podem ter ação mitogênica, sendo responsáveis pela proliferação de determinados tipos celulares, ou ação morfogênica, quando comanda alterações do fenótipo de células-alvo. Pode-se afirmar que seus efeitos são mediados por receptores de superfície das células-alvo, como fatores de crescimento derivados das plaquetas (PDGF), similares a IGFs, TGF-ß e proteínas ósseas morfogenéticas (BMPs)^27,28.

Na odontologia, destaca-se um grupo de fatores de crescimento, o das BMPs, que estão presentes nos extratos indutores da matriz óssea. Corroborando com os resultados positivos advindos da ET, as BMPs contribuem de forma significativa no aumento do reparo ósseo²⁹ de lesões no palato e na mandíbula³⁰.

Angiogênese

A angiogênese consiste na formação de novos vasos sanguíneos. É um mecanismo essencial para o crescimento, o reparo e a cicatrização de tecidos. A angiogênese contribui diretamente para o sucesso da ET, haja vista que é dependente da vascularização dos enxertos produzidos¹⁰. Assim, para que o tecido criado por ET receba aporte sanguíneo, é preciso que os vasos sanguíneos sejam funcionais e que se anastomosem com o sistema vascular do hospedeiro, fato que é um dos grandes desafios nessa área³¹.

A neovascularização, por sua vez, é um evento crítico, pois as células podem permanecer vivas por difusão somente quando estão próximas a um suprimento de sangue³². Para induzir a neovascularização de tecidos hipóxicos, pode-se utilizar uma abordagem de administração de fatores de crescimento pró-angiogênicos, como o fator de crescimento vascular endotelial (VEGF)³³. Contudo, no que diz respeito à angiogênese, a geração de cartilagem articular não é um entrave significativo, pois diferente de outros tipos de tecidos essa estrutura mostra-se avascular¹⁰.

Engenharia tecidual para obtenção de cartilagem articular: atualidade

Fonte de células responsivas

A fonte ideal de células para a engenharia de cartilagem é aquela que pode ser facilmente isolada e ampliada, em cultivo in vitro, e que sintetiza abundantes componentes específicos de MEC, como agrecana e colágeno tipo II. Dessa forma, as células mais estudadas para essa finalidade são os condrócitos e as células-tronco³⁴.

Os condrócitos são células capazes de produzir, manter e remodelar a MEC da cartilagem^35,36. Essas células podem ser utilizadas em tratamentos de algumas desordens de saúde, pois são capazes de reparar de forma eficaz defeitos articulares³⁷. No entanto, algumas desvantagens são observadas, como a falta de disponibilidade de condrócitos autólogos e a diminuição da funcionalidade de células coletadas nas articulações de pacientes doentes. Além disso, condrócitos cultivados em monocamadas sofrem desdiferenciação, caracterizada pela diminuição da síntese de proteoglicanos e expressão de colágeno do tipo II e aumento de expressão de colágeno tipo I^35,36.

A idade do doador dos condrócitos exerce influência no cultivo in vitro¹. Condrócitos de jovens doadores demonstram proliferação mais rápida e potencial condrogênico aumentado em relação a condrócitos de doadores mais velhos, sendo essas células metabolicamente menos ativas in vitro³⁸. Essas limitações podem ser parcialmente compensadas com a condição de cultivo, como utilização de biorreatores³⁹, tensão de oxigênio reduzida⁴⁰ e adição de fatores de crescimento⁴¹. No entanto, o uso dessas células para reparar a cartilagem não parece favorável.

Um aspecto desfavorável para a utilização dessas células é o fato de que, por exemplo, os condrócitos costais (CC) por si só não são capazes de atenuar a ossificação do tecido cartilaginoso. Contudo, com o cocultivo de CC e de células-tronco da polpa de dentes permanentes (DPSCs) na presença do fator de crescimento fibroblástico-9 (FGF-9), é possivel aperfeiçoar a diferenciação das DPSCs em tecido cartilaginoso e inibir parcialmente a sua mineralização³⁷.

Células-tronco

Uma possível solução para superar a oferta limitada de condrócitos é a utilização de células-tronco multipotentes, principalmente células com origem na medula óssea e no tecido adiposo.

As células-tronco derivadas da medula óssea (BMSCs) podem ser facilmente obtidas e induzidas a se diferenciar em cartilagem, para posterior expansão in vitro8. As células-tronco derivadas de tecido adiposo (ADSCs) são capazes de se diferenciar em condrócitos, utilizando sistemas de cultivo 3D na presença de ácido ascórbico, dexametasona e TGF-β42. Embora estudos apontem a produção de componentes da matriz bem como o aumento de propriedades mecânicas, destaca-se que o potencial condrogênico é menor se comparado com BMSCs.

Neste contexto, a melhor compreensão dos mecanismos moleculares que regulam a diferenciação mostra-se essencial. Bobick et al.⁹ (2010) relataram pela primeira vez que as vias de sinalização ERK5 e ERK1/2 (proteínas quinase ativadas por mitógenos) desempenham papéis opostos na regulação da condrogênese de BMSCs. Desse modo, a via de sinalização ERK5 mostra-se como regulador negativo da formação de cartilagem, enquanto a via ERK1/2 mostra-se como regulador positivo⁹.

Agentes morfogênicos

Diversas citocinas, hormônios e fatores de crescimento podem influenciar os processos anabólicos e catabólicos dos condrócitos. Portanto, um grande número de fatores de crescimento, incluindo TGF-β, IGF-1, BMPs e, em menor grau, FGFs e fator de crescimento epidérmico (EGF), tem sido utilizado em estudos de ET de cartilagem in vitro para promover o fenótipo condrogênico, estimular a produção de MEC e promover condrogênese de células-tronco mesenquimais (CTMs)⁴³.

Outro estudo corrobora os achados anteriores e aponta que a interação celular de CTMs na forma de cultivo em micromassas (células dissociadas que são reagregadas em esferoides, evitando a utilização de scaffold) pode regular a proliferação e diferenciação das CTMs do periósteo durante condrogênese, e que este efeito é reforçado quando na presença de TGF- β3⁴⁶.

O IGF-1 pode estimular a atividade anabólica de condrócitos e induzir à condrogênese de CTM⁴⁷. As BMPs, especialmente BMP-2 e BMP-7, promovem também a condrogênese de CTMs e aumentam a produção de MEC pelos condrócitos e CTMs³. Assim, uma combinação de fatores de crescimento nas culturas de condrócitos e CTMs in vitro pode potencializar os efeitos sobre essas células⁴⁸.

No entanto, o efeito da aplicação de moléculas de sinalização não é apenas dependente do tipo de fator que é aplicado. Outros parâmetros também estão envolvidos, como a dose, o tempo de administração e o tipo de célula em que atuam⁴⁹.

Scaffolds

Quando, por meio da ET, tenta-se reestabelecer um tecido cartilaginoso, a técnica baseia-se em cultivar os condrócitos em uma matriz artificial, biodegradável, que possa suportar o crescimento da cartilagem durante alguns meses, enquanto os condrócitos e a MEC se estabelecem, sem alterações fenotípicas. O scaffold, por sua vez, degrada-se gradualmente, em oito a dez semanas após o implante de cartilagem⁵⁰.

Diferentes sistemas de cultura são usados na expansão dos condrócitos: a cultura de condrócitos em monocamadas⁴ e a cultura em sistema tridimensional em esponjas de colágeno, fibrina, gel de agarose, hidrogel de alginato, quitosana, etc¹.

Polímeros naturais

Os polímeros naturais podem ser classificados, quanto à constituição, em proteínas, como fibrina e colágeno, e em carboidratos, como agarose, alginato, ácido hialurônico e quitosana. Muitos desses são hidrogéis, o que os torna apropriados para a engenharia de cartilagem que tem alto conteúdo de água. A característica mais atrativa de hidrogéis é que as células encapsuladas em scaffolds conseguem manter seu fenótipo de condrócitos esféricos e não desdiferenciam⁵¹.

Além disso, uma nova perspectiva é a incorporação de nano e microfibras de titânio e de hidroxiapatita em hidrogéis de alginato. Esse método proporciona um scaffold com características físicas melhoradas e, concomitantemente, gera um ambiente mais adequado para adesão e proliferação celular⁵². Não obstante, os scaffolds à base de hidrogel são também interessantes para estudos que empregam carga mecânica, pois são capazes de transduzi-la, de modo que as forças podem ser exercidas sobre as células⁵¹.

Os polímeros sintéticos mais utilizados em scaffolds são os poli-hidroxi-α-ésteres, especialmente o ácido polilático (PLA) e o ácido poliglicólico (PGA), devido à sua biodegradabilidade. Scaffolds feitos à base de polímeros sintéticos, quando comparados com hidrogéis, apresentam melhor resistência mecânica⁵³. Além disso, as propriedades dos scaffolds sintéticos podem ser alteradas, permitindo ajustar, por exemplo, a taxa de degradação, suas características estruturais e de resistência mecânica. Em contrapartida, uma desvantagem dos polímeros sintéticos é que as células muitas vezes não mantêm seu fenótipo normal e produzem MEC com propriedades inferiores em relação aos scaffolds à base de polimeros naturais⁵⁴.

Arquitetura, porosidade e rigidez

A porosidade, o tamanho dos poros e a interconectividade do scaffold são propriedades importantes, uma vez que influenciam a migração celular e a difusão de oxigênio, nutrientes, produtos residuais e moléculas de sinalização⁵⁵. Por exemplo, a oferta de oxigênio não homogênea da periferia ao centro da cultura pode levar à morte celular nas regiões centrais⁵⁶.

Além disso, um material poroso melhora mecanicamente a relação entre o implante e a cartilagem natural, proporcionando uma maior estabilidade mecânica na interface. Tem sido observado que o tamanho ideal dos poros para promover a proliferação é entre 100 mm e 500 mm⁵⁷.

A rigidez dos scaffolds também influencia na diferenciação e no crescimento das células em cultura de tecidos. O aumento da rigidez influencia na morfologia dos condrócitos, que passa de uma forma arredondada com actina nebulosa e substratos mais fracos a uma forma predominante com morfologia plana, com fibras de actina sobre estresse e substratos mais rígidos⁵⁸.

Odontologia e tecido cartilaginoso

Quando os tópicos odontologia e tecido cartilaginoso são abordados concomitantemente, duas questões podem surgir: como reabilitar pacientes com desordens no disco cartilaginoso da articulação temporomandibular (ATM) e como os tecidos bucais podem servir de fonte celular para criar tecido cartilaginoso.

Cabe destacar que as desordens na ATM comprometem a porção cartilaginosa do côndilo e dão origem a novas investigações na área da ET, que busca sanar o desafio de reconstruir cartilagem e minimizar defeitos cartilaginosos⁵⁹. Assim, estudos em modelo animal mostram que é possível reconstituir, em poucos meses, todos os elementos da cartilagem condilar⁶⁰. Discos substitutos foram gerados a partir de ET, utilizando scaffolds altamente porosos e biorreabsorvíveis, semeados com condrócitos. Após doze semanas foi obtida uma neocartilagem, que mostrou evidências histológicas de cartilagem hialina organizada⁶¹.

Também, não menos importante, vale ressaltar que a cavidade oral tem múltiplos sítios fontes de células-tronco, como o tecido pulpar de dentes decíduos¹⁷ e permanentes¹⁸, o ligamento periodontal¹⁹ e a papila apical de dentes não totalmente desenvolvidos²⁰. Dentre essas células, destacam-se as de origem pulpar, já que os dentes são facilmente obtidos por motivos ortodônticos, periodontais, cárie e exfoliação natural de decíduos⁶². Além disso, essas células possuem a capacidade de diferenciação em tecido condrogênico^63,64.

Conclusão

Os tratamentos atuais para o reparo de danos da cartilagem articular apresentam sérias limitações. Nesse âmbito, a engenharia de tecidos poderia contornar essas limitações pela geração de cartilagens substitutivas in vitro. Contudo, os componentes da tríade necessitam de aperfeiçoamento antes da aplicação clínica. Com isso, acredita-se que as células-tronco multipotentes são promissoras em relação à disponibilidade, porém faz-se necessário elucidar mecanismos de geração da MEC.

Além disso, os scaffolds de polímeros sintéticos mostram-se vantajosos por facilitarem o controle das propriedades de carga e degradação, entretanto, muitas vezes são incapazas de manter o fenótipo dos condrócitos. Quanto aos agentes morfogênicos, inúmeros aspectos devem ser considerados e adaptados ao tipo de célula cultivada, como o tipo de agente, sua concentração e tempo de exposição. Finalmente, além de contornar as limitações dos componentes da tríade, deve-se considerar a aplicação de estímulos mecânicos e propriedades de superfície a fim de gerar uma cartilagem articular com características satisfatórias para a aplicação in vivo.

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Endereço para correspondência:
Fernanda Nedel
Programa de Pós-Graduação em Saúde e Comportamento
Universidade Católica de Pelotas ]]> Rua Gonçalves Chaves, 377, sala 411 prédio C, Centro
96015-560 Pelotas, RS
e-mail: fernanda.nedel@gmail.com

Recebido: 17/11/15
Aceito: 28/09/15