Atividade antifúngica e antiaderente do óleo essencial de Rosmarinus officinalis sobre Candida

Autor correspondente

RESUMO

Objetivo: Avaliar a atividade antifúngica e antiaderente do óleo essencial de Rosmarinus officinalis (Alecrim) sobre Candida albicans (ATCC289065) e C. tropicalis (ATCC40042). Materiais e Métodos: Determinou-se a atividade antifúngica pela Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Fungicida Mínima (CFM), obtidas através das técnicas de microdiluição e de esgotamento, respectivamente. Os produtos foram avaliados da concentração inicial de 72mg/mL até 0,5625mg/mL. A atividade antiaderente foi avaliada segundo as concentrações CIM, 2CIM e 4CIM. Em tubos de vidro estéreis, foram adicionados: 1 corpo de prova de resina acrílica estéril; 2mL de Caldo Sabouraud-Dextrose estéril; 0,2mL do inoculo fúngico e 2mL do óleo essencial de R. officinalis nas concentrações testadas, ou água destilada estéril (Controle de Crescimento), ou nistatina (100.000UI/mL – Controle Positivo). Os produtos testados foram adicionados em duas condições: junto aos demais componentes do dispositivo de aderência (t=0h); e após 24h da inserção desses componentes (t=24h). Os microrganismos que aderiram aos corpos de prova foram dispersos, diluídos 10 e 100 vezes em água destilada estéril e transferidos, em triplicata, para placas de agar Sabouraud Dextrose 4%. Após 48 horas de incubação a 37ºC, o número de Unidades Formadoras de Colônia por mililitro (UFC/ mL) foi determinada para cada espécime. Aplicaram-se os testes Mann Whitney e ANOVA (pós-testes de Tukey e Dunnet). Resultados: A CIM e CFM foram determinadas na concentração 0,5625mg/mL. Quando comparado ao controle de crescimento, o óleo essencial de R. officinalis provocou inibição da aderência em todas as concentrações testadas, porém com efeito inferior à nistatina. Observou-se maior atividade antiaderente para t=24h (p<0,001) e maior concentração do produto natural (p<0,05). Conclusão: O óleo essencial de R. officinalis exerceu atividade antifúngica e antiaderente sobre C. albicans e C. tropicalis. Melhor desempenho foi observado para concentração 2,25mg/mL (4CIM) do óleo essencial de R. officinalis.

Descritores: Óleos voláteis. Produtos biológicos. Candidíase bucal. Produtos com ação antimicrobiana.

ABSTRACT

Uniterms: Oils, volatile. Biological products. Oral candidiasis. Products with antimicrobial action.

INTRODUÇÃO

A candidíase bucal é uma das infecções humanas de natureza fúngica mais comum; sendo descrita como uma infecção oportunista, frequentemente envolvida com a alteração da microbiota bucal, doenças sistêmicas e redução da imunidade do hospedeiro^1,2. Entre as cepas envolvidas com o desenvolvimento da candidíase bucal, a Candida albicans é a espécie mais prevalente e de maior patogenicidade^1,3. C. tropicalis, C. krusei, C. parapsilosis e C. guilliermondii também fazem parte do curso da doença e, junto a C. albicans, chegam a representar mais de 80% dos isolados clínicos^1,3.

Segundo Rex et al.⁴ e Khan et al.⁵, as espécies de Candida têm se mostrado resistentes diante da utilização de alguns medicamentos antifúngicos sintéticos. Com o objetivo de identificar substâncias alternativas ao uso de medicamentos tradicionais, foram desenvolvidos estudos sobre a atividade antimicrobiana de óleos essenciais^6-9.

Desta forma, a busca de produtos naturais que apresentem uma ação antifúngica eficiente frente a microrganismos resistentes se mostra uma alternativa necessária para o controle da candidíase bucal^6,9. A atividade fungiostática do óleo essencial de Rosmarinus officinalis (Alecrim) foi apontada por Lima et al.⁶, Fontenelle et al.⁷ e Pozzatti et al.⁸, os quais empregaram diferentes técnicas. Segundo Fontenelle et al.⁷, o óleo essencial de R. officinalis apresenta atividade antifúngica sobre Candida em baixas concentrações. Porém, não foram identificados estudos sobre a atividade antiaderente deste produto natural. Assim, verificase a necessidade de aprofundar as investigações sobre a atividade antifúngica desses produtos, com o objetivo de justificar e validar o uso clínico dos óleos essenciais.

Esta pesquisa se justifica pela necessidade de produzir novas informações sobre os efeitos fungiostático, fungicida e antiaderente dos óleos essenciais sobre Candida. O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade antifúngica e antiaderente do óleo essencial de Rosmarinus officinalis (Alecrim) sobre Candida albicans e Candida tropicalis.

Realizou-se um estudo de abordagem indutiva, com procedimento comparativo descritivo e técnica de documentação direta em laboratório¹⁰.

Microrganismos utilizados

As cepas de referência utilizadas no estudo foram Candida albicans (ATCC 289065) e C. tropicalis (ATCC 40042). Os microrganismos foram obtidos do Laboratório de Materiais de Referência do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (Fundação Oswaldo Cruz – FIOCRUZ, Rio de Janeiro - RJ, Brasil). As cepas foram reativadas em Caldo Sabouraud-Dextrose (DIFCO®, Detroit, Michigan, EUA), a 37ºC e estocadas em Àgar Sabouraud-Dextrose 4% (DIFCO®, Detroit, Michigan, EUA) no Laboratório de Microbiologia Oral – Núcleo de Medicina Tropical do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Paraíba. Para condução do estudo, suspensões fúngicas dos microrganismos foram preparadas em solução salina, sob a concentração 1,5x106 microrganismos/mL, equivalente ao tubo 106 da Escala de MacFarland.

Produtos testados

Para avaliação antiaderente in vitro foi utilizado o óleo essencial de Rosmarinus officinalis (alecrim), obtido da empresa Ferquima® (Ind. e Com. Ltda. Vargem Grande Paulista-SP, Brasil), a qual cedeu Laudo Técnico com especificações. Utilizou-se o lote 141 do óleo essencial de R. officinalis (Alecrim), isento de impurezas, oriundo da Tunísia e com densidade 0,912g/mL (20ºC). Os principais componentes identificados foram 1,8 Cineol, limoneno, para-cimeno, α-pineno e Cânfora.

Confecção dos corpos de prova

Para montagem dos dispositivos de aderência fúngica, foram confeccionados corpos de prova de resina acrílica incolor quimicamente polimerizável (Vipi Flash, VIPI Produtos Odontológicos Ltda., Pirassununga-SP, Brasil), com dimensões 10x10x5mm. Os espécimes foram preparados de acordo com as instruções do fabricante (temperatura de 25ºC, em igual proporção de pó e líquido, sem incorporação de bolhas de ar), e posteriormente imersos em água destilada por 24h, a 37ºC, para liberação de monômero residual. As superfícies dos corpos de prova foram submetidas ao acabamento e polimento com lixas d'água de granulação 200, 400 e 600 (3M-ESPE, Campinas-SP, Brasil) e posteriormente limpas com aparelho ultra-sônico. Todos os espécimes foram armazenados em tubo de vidro com água destilada e esterilizados em autoclave (121ºC durante 20 minutos) para posterior utilização.

Ensaio da avaliação antifúngica de R. officinalis sobre C. albicans e C. tropicalis

O óleo essencial utilizado neste estudo foi inicialmente diluído em água destilada estéril e Tween 80 (Farmafórmula Farmácia de Manipulação, João Pessoa-PB, Brasil), obtendo-se a concentração 16%, considerada a solução-padrão inicial para todos os produtos avaliados. Para obtenção dessas diluições, considerou-se a densidade do produto igual a 0,9 g/mL, conforme especificações do fornecedor. Utilizou-se o método de diluição descrito por Lima et al.6 e Aligiannis et al.11 e, no qual foram adicionados em tubos de vidro estéril: 0,8 mL do óleo essencial; 0,05 mL de Tween 80; e 4,2 mL de água destilada estéril. O conjunto foi agitado durante 5 minutos em aparelho agitador de soluções tipo Vortex (Mod. AP56, Phoenix, Araraquara-SP, Brasil) e a concentração final obtida foi de 16%, equivalente a 144 mg/mL. Para avaliação da Concentração Inibitória Mínima (CIM), os óleos essenciais foram diluídos de forma seriada, mediante emprego da técnica da microdiluição^9,11.

De modo a validar a metodologia empregada neste estudo, empregou-se o Controle Positivo (nistatina - suspensão comercial - 100.000 UI/mL); o Controle de Crescimento (suspensão fúngica em desenvolvimento, sem adição de antifúngicos); e o Controle de Esterilidade (Meio de cultura estéril, sem adição de antifúngicos ou suspensões de microrganismos)

Posteriormente, foram inseridos 10μL da suspensão fúngica de C. albicans ou de C. tropicalis (1,5x106 microrganismos/mL) em todos os poços, exceto à coluna correspondente ao Controle de Esterilidade. As placas foram incubadas em estufa bacteriológica a 37º, por 48h. A CIM correspondeu à última diluição dos óleos essenciais na qual não foi verificada a presença de precipitado fúngico ou turvação no meio de cultura após o período de incubação^8,11.

A Concentração Fungicida Mínima (CFM) foi obtida por meio da semeadura, em Ágar Sabouraud-Dextrose, de alíquotas de 10μL das diluições correspondentes a CIM e duas imediatamente anteriores (2CIM e 4CIM)^8,9. Após a semeadura dos conteúdos dos poços das placas de microdiluição, as placas de petri foram incubadas em estufa bacteriológica a 37º, por 24h. A CFM foi considerada a menor concentração substância que impediu o crescimento visível do subcultivo ou a formação de até três Unidades Formadoras de Colônia (UFC)8. Os ensaios para determinação da CIM e CFM foram realizados em triplicata.

Ensaio da avaliação antiaderente de R. officinalis sobre C. albicans e C. tropicalis

A atividade antiaderente do óleo essencial de R. officinalis sobre C. albicans e C. tropicalis foi avaliada separadamente, segundo a técnica descrita por Carreto et al.¹². O óleo essencial de R. officinalis foi avaliado nas concentrações correspondentes a CIM e duas imediatamente superiores (2CIM e 4CIM). Em tubos de vidro estéril foram adicionados: um corpo de prova de resina acrílica estéril; 0,2mL da suspensão fúngica de C. albicans ou de C. tropicalis; 2mL de Caldo Sabouraud-Dextrose estéril; 2mL da diluição do óleo essencial de R. officinalis ou água destilada estéril (controle de crescimento) ou nistatina 100.000UI/mL (controle positivo)¹². Os tubos foram tampados e incubados em estufa bacteriológica a 37ºC por 48h. O controle de esterilidade do meio de cultura e dos corpos de prova foi verificado pela ausência de turvação do meio nos tubos sem a adição do inoculo e dos produtos testados.

A atividade antiaderente do óleo essencial de R. officinalis e do controle positivo foi avaliada em duas condições: o produto foi inserido junto aos demais componentes do dispositivo de aderência (t=0h); e o produto foi inserido após 24h da inserção dos demais componentes (t=24h). Na primeira condição, prevalece o estado planctônico das células; enquanto na segunda situação se verifica a formação de agregados celulares, a secreção de matriz extracelular e adesão¹³. Dessa forma, nos tubos correspondentes a condição t=24h, o óleo essencial de R. officinalis ou a nistatina 100.000UI/ mL (controle positivo) foram inseridos somente após 24h do processo de incubação.

Após a incubação por 48h, os corpos de prova foram transferidos para tubos de ensaio contendo 1mL de solução fisiológica estéril (NaCl 0,85%), e agitados em um agitador de tubos (Vortex) por 60 segundos. Os microrganismos que aderiram aos corpos de prova foram dispersos, diluídos 10 e 100 vezes em água destilada estéril e transferidos, em triplicata, para placas de agar Sabouraud Dextrose 4%12. Após 48 horas de incubação a 37ºC, o número de Unidades Formadoras de Colônia por mililitro (UFC/mL) foi determinada para cada espécime. As placas escolhidas para a contagem foram aquelas que apresentaram entre 30 e 300 colônias¹². Placas com mais de 300 colônias foram consideradas incontáveis.

Análise estatística

Para a avaliação da atividade antifúngica, as diluições seriadas nas quais se observou CIM e/ ou CFM foram analisadas descritivamente. Para avaliação da atividade antiaderente, o número de UFC/mL consistiu nas unidades de comparação estatística. Os resultados, expressos em UFC/mL, foram analisados segundo a concentração do óleo essencial de R. officinalis (CIM, 2CIM, ou 4CIM) e segundo o estado de desenvolvimento microbiano (t=0h – estado planctônico; t=24h – estado de agregação).

RESULTADOS

Considerando a avaliação antifúngica do óleo essencial de R. officinalis, a metodologia empregada neste estudo foi validada pela ausência de crescimento fúngico para o Controle de Esterilidade e Controle Positivo (nistatina - 100.000 UI/mL), bem como pela presença de crescimento fúngico para o controle de crescimento. A CIM e a CFM do óleo essencial de R. officinalis frente as cepas C. albicans (ATCC289065) e C. tropicalis (ATCC40042) foi igual a 0,5625mg/ mL. Conforme os resultados obtidos para a CIM e CFM do óleo essencial de R. officinalis sobre C. albicans e C. tropicalis, os valores de CIM, 2CIM, 4CIM foram iguais a, respectivamente, 0,5625mg/ mL; 1,125mg/mL e 2,25mg/mL.

Observou-se ausência de aderência fúngica para os corpos de prova correspondentes ao Controle Positivo (nistatina - 100.000UI/mL) e para o Controle de Esterilidade, bem como pela presença de aderência fúngica para o Controle de Crescimento. A Tabela 1 apresenta os resultados da ação antiaderente do óleo essencial de R. officinalis sobre C. albicans e C. tropicalis segundo a concentração (CIM, 2CIM, ou 4CIM) e segundo o estado de desenvolvimento microbiano (t=0h – estado planctônico; t=24h – estado de agregação).Considerando o estado planctônico (t=0h) das cepas C. albicans e C. tropicalis, as concentrações 1,125mg/mL (2CIM) e 2,25mg/mL (4CIM) apresentaram maior atividade antiaderente do que a concentração 0,5625mg/ mL (CIM), sendo esta diferença estatisticamente significante (p<0,05). Para o estado de agregação celular (t=24h), as concentrações 0,5625mg/mL e 2,25mg/mL apresentaram maior inibição da aderência de C. albicans e C. tropicalis do que a concentração 1,125mg/mL, sendo observada diferença estatisticamente significante (p<0,05). Comparando-se os resultados obtidos para t=0h e t=24h, observou-se maior atividade antiaderente para t=24h, sendo esta diferença estatisticamente significante (p<0,001).

A partir das análises estatísticas verificou-se que, para t=0h e t=24h, a concentração de 2,25mg/ mL (4CIM) provocou maior inibição da aderência de C. albicans e C. tropicalis. Quando comparados ao controle de crescimento das cepas testadas, o óleo essencial de R. officinalis (nas concentrações CIM, 2CIM e 4CIM) provocou redução significativa do total de Unidades Formadoras de Colônias por mililitro. Quando comparadas à nistatina, as concentrações testadas do óleo essencial provocaram menor inibição da aderência de C. albicans e de C. tropicalis

DISCUSSÃO

As técnicas para determinação da CIM e CFM empregadas neste estudo foram baseadas nos protocolos descritos por Aligiannis et al.¹¹ e Castro & Lima⁹, os quais representam modificação das normas estabelecidas pelo National Comitte for Clinical Laboratory Standard (NCCLS)¹⁴. O método de referência para técnica de microdiluição e determinação da sensibilidade de leveduras à terapia antifúngica (M7-A2), descrita por NCCLS¹⁴, considera a avaliação de antifúngicos sintéticos, a utilização do meio de cultura RPMI-1640 e a padronização da concentração inicial das substâncias testadas em 64μg/mL ou 16 μg/mL.

O presente estudo foi desenvolvido em condições diferentes das estabelecidas por NCCLS¹⁴. Segundo Nascimento et al.¹⁵, a normatização M7- A2 proposta pelo NCCLS não pode ser seguida à risca quando da avaliação antimicrobiana de óleos essenciais. Considera-se que as propriedades químicas desses produtos naturais diferem daquelas apresentadas pelas substâncias para qual a norma foi padronizada, ou seja, a normatização do NCCLS não atende às especificidades dos óleos essenciais¹⁵. Dessa forma, foi reproduzido o protocolo descrito por Aligiannis et al.¹¹ e por Castro & Lima⁹, no qual foi empregado o meio de cultura Caldo Sabouraud-Dextrose, a nistatina como controle positivo, a diluição seriada dos produtos testados e a incorporação de emulsificante (Tween 80) na preparação dos óleos essenciais.

Os óleos essenciais são substâncias voláteis, que apresentam insolubilidade em água e complexidade química, o que dificulta a padronização de técnicas confiáveis, que possam ser reproduzidas e validadas, de modo a alcançar resultados seguros^9,15,16. Dessa forma, para minimizar a inconsistência dos resultados obtidos, foi empregada a técnica de microdiluição em caldo, com o objetivo de proporcionar maior contato entre os produtos testados e as células fúngicas. Utilizouse também um agente emulsificante (Tween 80) para permitir a diluição dos óleos essenciais em meio aquoso. Essas medidas contribuem para redução de viés metodológico e comparação entre os produtos naturais testados^9,16. Ao comparar as técnicas de disco-difusão e microdiluição para avaliação da atividade antifúngica de produtos naturais, Scorzoni et al.¹⁶ identificaram que a microdiluição foi mais sensível para determinação da CIM.

O Controle Positivo (nistatina - suspensão comercial - 100.000 UI/mL), o Controle de Esterilidade e o Controle de Crescimento foram empregados de modo a validar a técnica utilizada neste estudo e permitir a comparação com os resultados do óleo essencial. O Controle de Esterilidade confirmou a ausência de contaminação extrínseca do meio de cultura e dos corpos de prova. O Controle de Crescimento comprovou a viabilidade das cepas que não recebeu tratamento antifúngico. A ausência de crescimento fúngico diante da nistatina (100.000 UI/mL) evidenciou a susceptibilidade das amostras frente a um antifúngico sintético. No entanto, as diferenças entre a natureza química do óleo essencial e do Controle Positivo não permitem comparar os resultados obtidos por essas substâncias¹⁵.

Os resultados deste estudo apontaram que o melhor desempenho do óleo essencial de R. officinalis foi observado para concentração de 2,25mg/mL (4CIM). Entretanto, o efeito provocado pela nistatina na redução do total de UFC/mL das cepas testadas foi estatisticamente superior ao apresentado pelo produto natural (p<0,01). Portanto, considerou-se que o óleo essencial de R. officinalis, nas concentrações testadas, apresentou atividade antiaderente menos efetiva que a nistatina.

A atividade antifúngica do óleo essencial de R. officinalis foi demonstrada por Lima et al.⁶ e Packer & Luz¹⁷, os quais utilizaram a técnica de difusão em agar e identificaram ação fungiostática em concentrações superiores a 8%. Segundo Fontenelle et al.⁷, o óleo essencial de R. officinalis frente C. albicans e C. tropicalis apresentou CIM entre 0,62mg/mL e 2,5mg/mL, e CFM entre 1,25mg/ mL e 2,5mg/mL, determinados pela técnica de microdiluição. Dessa forma, os resultados deste estudo corroboram os achados de Fontenelle et al.⁷. Não foram encontradas na literatura estudos sobre a atividade antiaderente do óleo essencial de R. officinalis.

Segundo Chandra et al.¹³, as células de Candida tem a capacidade de realizarem coagregação e excretar matriz extracelular, o que contribui para a aderência a superfícies acrílicas e poliméricas. Os resultados de Chandra et al.¹³ demonstraram que as células de C. albicans, quando em estado planctônico, são mais susceptíveis a ação de antifúngicos. Os autores consideraram que a secreção de matriz extracelular e o estado de agregação contribuíram para maior resistência antifúngica.

Os resultados deste estudo evidenciaram diferenças entre a ação dos produtos testados na fase planctônica (t=0h) e no estado de agregação (t=24h). Verificou-se que a ação antiaderente do óleo essencial de R. officinalis, sob todas as concentrações testadas, foi menor em t=0h do que em t=24h. Assim, este estudo demonstrou que o estado de agregação celular foi mais sensível à ação dos produtos testados, o que contraria a hipótese levantada por Chandra et al.¹³.

Nas condições deste estudo, verificou-se que o óleo essencial de R. officinalis apresentou atividade antifúngica e antiaderente sobre C. albicans e C. tropicalis. A interação de C. albicans e C. tropicalis com outros microrganismos na constituição do biofilme oral também pode contribuir para maior susceptibilidade desta cepa à ação de antifúngicos¹⁸. Estudos posteriores devem considerar a ação deste produto sobre cepas clínicas e outras linhagens padronizadas, através de técnicas que considerem a influência da saliva humana, e interação com outros microrganismos orais.

CONCLUSÃO

Concluiu-se que o óleo essencial de R. officinalis exerceu atividade antifúngica e antiaderente sobre C. albicans e C. tropicalis. As cepas testadas apresentaram inibição do crescimento quando expostas a concentração 0,5625mg/mL do óleo essencial de R. officinalis. O estado de agregação celular (t=24h) e a maior concentração do produto natural contribuíram para maior atividade antiaderente do produto natural. Melhor desempenho foi observado para concentração 2,25mg/mL (4CIM) do óleo essencial de R. officinalis, sendo o efeito antifúngico inferior ao apresentado pela nistatina.

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Autor correspondente:
Yuri Wanderley Cavalcanti
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Recebido em 10/02/2011 – Aceito em 24/05/2011